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Eliminación de la metionina inicial en Venus para FRET

Eliminación de la metionina inicial en Venus para FRET


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Estoy trabajando en la construcción de algunos reporteros FRET. Además de un sitio de escisión (de composición variable de 15-18AA), un enlazador de 1 AA, estoy usando Venus y Cerulean.

Inicialmente me preocupaba que 18AA fuera demasiado largo, pero de hecho da una señal justa. Como referencia, creo que el radio de Förster (Ro) es 54Å.

Ahora estoy trabajando en una mayor optimización. ¿La eliminación de la metionina inicial causa algún problema para Venus si es la segunda proteína del par FRET? El diseño básico es:

Cerúleo - Enlace - Escote - Enlace - Venus

Y me pregunto si cortar el Met de Venus podría acercarme 1 AA y, por lo tanto, una señal ligeramente mejor. Lo he visto publicado en ambos sentidos, y me preguntaba si alguien había probado ambos o simplemente sabía teóricamente que no importaría.


La proteína Ras activada acelera la progresión del ciclo celular para perturbar la cistogénesis renal canina Madin-Darby *

En varias células cancerosas humanas, el K-RAS se muta y activa con frecuencia de manera constitutiva, lo que culmina en la inducción del crecimiento celular continuo, un sello distintivo de las células cancerosas. Sin embargo, todavía no está claro cómo el K-RAS mutado induce anomalías morfológicas en los tejidos cancerosos. Para investigar el mecanismo subyacente a los cambios morfológicos inducidos por K-RAS, utilizamos un sistema de expresión de proteínas dependiente de auxinas, que nos permitió inducir y evaluar rápidamente K-Ras constitutivamente activo en quistes MDCK (riñón canino Madin-Darby), un modelo para estructura epitelial polarizada. Células portadoras del constitutivamente activo KRasV12 Los genes eran morfológicamente indistinguibles de las células normales en cultivo bidimensional. Sin embargo, en un gel de matriz extracelular, las células que expresan KRasV12 no lograron formar un quiste esférico. Cuando la inducción de KRasV12 se retrasó hasta después de la formación del quiste, algunas células de la pared del quiste perdieron polaridad y se extruyeron y se acumularon en el espacio luminal. Con mutantes efectores específicos de KRasV12 e inhibidores de MEK y PI3-quinasa, encontramos que tanto los ejes Raf-MEK-ERK como PI3-quinasa son necesarios y suficientes para este fenotipo. Las imágenes de células vivas con indicadores del ciclo celular mostraron que la expresión de KRasV12 promovió la progresión del ciclo celular, que fue impedida por los inhibidores de MEK o PI3-quinasa. A partir de estos resultados, proporcionamos un modelo en el que active-Ras induce la progresión del ciclo celular que conduce a la extrusión de células apicales a través de Raf y PI3-quinasa de manera cooperativa. El sistema desarrollado aquí se puede aplicar a la detección de fármacos para varios cánceres que se originan en células epiteliales.

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón y la Fundación en Memoria de Mochida para la Investigación Médica y Farmacéutica.

Con el apoyo de becas de investigación de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia para Jóvenes Científicos.


Herramientas de una sola molécula, parte B: métodos de superresolución, seguimiento de partículas, multiparámetros y basados ​​en fuerzas

Michael A. Thompson,. NOSOTROS. Moerner, en Métodos en enzimología, 2010

2.4 EYFP como emisor fotoconmutable

El uso de EYFP como emisor fotoconmutable amplía enormemente la cantidad de muestras biológicas disponibles de inmediato para la obtención de imágenes de superresolución. En la mayoría de las imágenes de PALM informadas, la proteína fluorescente fotoactivable se ha seleccionado de varias construcciones sofisticadas como PA-GFP, Dronpa, Kaede, tdEosFP, Dendra2, rsFastLime, PA-mCherry y rsCherryRev (Betzig et al., 2006 Geisler et al., 2007 Niu y Yu, 2008 Stiel et al., 2008 Subach et al., 2009). Sin embargo, hace más de 10 años se demostró que los FP amarillos inmovilizados y aparentemente blanqueados (S65G, S72A, T203Y o S65G, S72A, T203F) se reactivan con luz violeta (Dickson et al., 1997), y la proteína fluorescente amarilla mejorada estrechamente relacionada EYFP (S65G, V68L, S72A, T203Y) se utilizó recientemente para la obtención de imágenes de PALM de células vivas de la C. crescentus proteína estructural MreB (Biteen et al., 2008). EYFP se usa ampliamente para fusiones de proteínas fluorescentes de rutina debido a la ausencia de perturbaciones fisiológicas como aglomeración y ubicación errónea, y las fusiones EYFP-MreB N-terminal se han demostrado previamente que son funcionales en C. crescentus y otras bacterias, lo que lo convierte en un sistema fisiológicamente relevante (Carballido-López y Errington, 2003 Figge et al., 2004 Gitai et al., 2004). Además, la obtención de imágenes de una sola molécula de EYFP-MreB con excitación de 514 nm ha demostrado previamente que esta proteína fluorescente es un emisor brillante de una sola molécula para la obtención de imágenes de células vivas (Kim et al., 2006 ).

La figura 2.5 muestra la fotorreactivación de EYFP en células vivas (Biteen et al., 2008). La Figura 2.5A muestra un cuadro de imagen único donde la imagen de fluorescencia se superpone sobre una imagen de transmisión de luz blanca de contraste negativo del C. crescentus celda. Se pueden identificar dos moléculas EYFP-MreB individuales en el panel A, que se adquirió después del paso de blanqueo inicial. Después de obtener más imágenes con luz de 514 nm, todos los fluoróforos se habían blanqueado, como se observa en el panel B. La reactivación de EYFP se logró después de este paso de blanqueo inicial mediante la administración de una dosis de 2 s de iluminación láser de 407 nm. Esta longitud de pulso, así como la intensidad de reactivación de 10 3 –10 4 W cm - 2, se eligió de modo que, como máximo, se reactivara una molécula de EYFP en cada región limitada por difracción y se activara un subensamblaje diferente de moléculas de EYFP en cada ciclo de este proceso.

Figura 2.5. Reactivación de fusiones EYFP-MreB en células vivas de C. crescentus. (A) Cuadros de adquisición únicos de 100 ms que muestran moléculas EYFP-MreB aisladas (a, c, ye) tras la fotoactivación y sin emisión de una sola molécula (b, d, f) después del fotoblanqueo. El punto en la parte inferior izquierda de cada imagen es un artefacto de imagen. (B) Reactivación a granel de una muestra de 22 células. Las líneas grises indican pulsos de 2 s de luz de 407 nm. (Adaptado y reproducido con permiso de Biteen et al., 2008. Copyright 2008 Nature Publishing Group.)

En la Fig. 2.5B, la intensidad de emisión total de 22 en vivo C. crescentus las células que expresan EYFP-MreB se muestran en función del tiempo. Después de un período de blanqueo inicial, se aplicaron destellos de energía de activación de 407 nm entre los ciclos de formación de imágenes. Estos ciclos de reactivación se utilizaron para calcular el rendimiento cuántico de fotorreactivación del fluoróforo EYFP. La relación medida entre el tiempo de activación y el porcentaje de reactivación se puede representar gráficamente y es casi lineal. En mediciones de EYFP-MreB en vivo C. crescentus células, 370 fotones son absorbidos por cada molécula de EYFP por segundo del pulso de activación. A partir de la pendiente del gráfico, se encontró un rendimiento cuántico de reactivación de 1,6 × 10 –6 para EYFP (Biteen et al., 2009). Este número está en el mismo orden de magnitud que el rendimiento cuántico de activación para PA-GFP, y solo un orden de magnitud menor que el rendimiento cuántico de fotoconmutación de la proteína de alta ingeniería, tdEos (ver Tabla 2.1). Por lo tanto, EYFP puede verse como un fluoróforo fotoconmutable útil para imágenes de súper resolución.


Introducción

Centralspindlin es un complejo heterotetramérico constitutivo 2: 2 conservado evolutivamente de una subunidad de kinesina-6 MKLP1 y una subunidad no motora CYK4. En este artículo, usaremos el término "MKLP1" para referirnos colectivamente a los ortólogos del mamífero KIF23 / MKLP1 [1], como Caenorhabditis elegans ZEN-4, y el término "CYK4" para denotar los ortólogos de C. elegans CYK-4 [2], como RACGAP1 / MgcRacGAP de mamíferos [3]. Centralspindlin juega un papel esencial en la citocinesis al formar estructuras de haces de microtúbulos del huso central y del cuerpo medio, al reclutar y regular varios factores en el sitio de división y al anclar la membrana plasmática en el puente intercelular mientras las células hijas esperan la abscisión [4-11 ]. Una mutación puntual en KIF23 / MKLP1 es la causa de la anemia diseritropoyética congénita tipo III, que se caracteriza por grandes eritroblastos multinucleados en la médula ósea [12]. Tanto las subunidades MKLP1 como CYK4 son esenciales para la agrupación de microtúbulos por centralspindlin [3,13]. In vitro, ni MKLP1 solo ni CYK4 solo pueden agrupar microtúbulos de manera eficiente. In vivo, el agotamiento de cualquiera de los componentes o mutaciones puntuales que afectan la formación del heterotetrámero del huso central causa los defectos del huso central [2,3,14-19]. Sorprendentemente, aunque las pantallas genéticas en C. elegans para los supresores de tales mutaciones que alteran el complejo (S15L en CYK-4 o D520N en ZEN-4) identificadas hasta ahora 15 mutaciones puntuales independientes, todas residen en regiones limitadas CYK-4 12–39 y ZEN-4 477–515. Es probable que estos hallazgos definan las interfaces de unión entre estas subunidades [3, 13] (resumidas en la Fig. 1A). Estos se incluyen en los dominios mínimos de CYK-4 y ZEN-4 suficientes para la reconstitución in vitro del complejo estable entre ellos (CYK-4 1–120 y ZEN-4 435–555). Estos datos enfatizan la importancia de la formación de heterotetrámeros para la agrupación de microtúbulos y sugieren que el ensamblaje del tetrámero se logra a través de dominios compactos sin contacto extenso, como un paquete largo de cuatro hélices. Sin embargo, no está claro cómo CYK4 contribuye a la agrupación de microtúbulos.

(A) Un esquema de las estructuras de dominio de CYK-4 y ZEN-4 y sus fragmentos expresados ​​como proteínas de fusión con etiquetas de purificación, que se eliminaron durante la purificación. Los segmentos verticales magenta y cian denotan los residuos cuya mutación interrumpe la interacción CYK-4-ZEN-4 y cuya mutación suprime el defecto de interacción, respectivamente. Los comportamientos esperados de las construcciones de ZEN-4 en dimerización, unión de microtúbulos (unión de MT) y agrupación se indican (+ o -) según los resultados anteriores [13,34], excepto para la unión de microtúbulos de Z555ΔN (*), que se basa en los resultados que se describen a continuación. CC1, CC2: bobina en espiral predicha con alta y baja propensión, respectivamente C1: dominio C1 RhoGAP: dominio de proteína activadora de GTPasa de la familia Rho Kinesina: dominio motor de kinesina ARFB: dominio de unión a ARF6 [9,10], BIO: biotinilación de 20 aa etiqueta. (B – E) Las preparaciones de proteínas utilizadas en este estudio se ejecutaron en geles SDS-PAGE y se visualizaron con tinción de Coomassie. Tenga en cuenta que la versión de Z601 utilizada en Z601 / C120, que carece de la etiqueta de biotinilación, mostró una movilidad ligeramente mayor que las utilizadas solo o en un complejo con C40G.

Aunque MKLP1, una quinesina-6 [20], tiene el dominio motor de la quinesina en su extremo N-terminal, es diferente de otras quinesinas N-terminales (N-quinesinas). En kinesins-1, -2, -3, -4, -5 y -7, el núcleo catalítico, que contiene un bolsillo de unión de ATP y una superficie de unión de microtúbulos, está conectado a la bobina enrollada a través de una secuencia corta conservada. motivo de unos 15 aa, denominado "enlazador del cuello" [21-23]. El conector de cuello se acopla al núcleo catalítico de una manera acoplada bidireccionalmente a los estados de unión de nucleótidos y microtúbulos del núcleo catalítico. Por lo tanto, juega un papel crucial en la generación de fuerza por dominios motores individuales y en la coordinación mecanoquímica entre las dos cabezas en dímeros de kinesina andantes. Curiosamente, MKLP1 no tiene un enlazador de cuello reconocible. En cambio, el núcleo catalítico de MKLP1 está conectado a la bobina enrollada a través de una secuencia de "cuello" más larga de 60-70 aa, que contiene residuos de prolina dispersos de hélice / rotura de bobina ("MKLP1" en la figura S1) [3]. Es importante destacar que esta región del cuello de MKLP1 contiene el sitio de unión CYK4. Debido a estas características mecánicas inusuales, la estructura molecular del complejo heterotetramérico centralspindlin de CYK4 y MKLP1 es de gran interés. Aunque un estudio reciente que utilizó espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica informó un cambio en la movilidad de los residuos del cuello de ZEN-4 sobre la unión de CYK-4 [24], no está claro cómo esto influye en la configuración de los dos dominios motores y cómo esto modula la agrupación de microtúbulos por el complejo.

Aquí realizamos la visualización directa de la estructura dinámica de centralspindlin por microscopía de fuerza atómica. Nuestros datos indican que la unión de CYK4 al dominio del cuello del dímero MKLP1 remodela la configuración entre los dos dominios motores. Además, mediante el uso de ensayos funcionales in vitro, demostramos que esta reconfiguración optimiza el complejo centralspindlin para la formación y acumulación de los haces de microtúbulos antiparalelos cruciales para la citocinesis.


2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Dado que MetQ tiene una alta afinidad por la l-metionina, la preparación de apo-MetQ requiere ciclos de desplegamiento y replegamiento para eliminar el ligando unido. 11 Como enfoque alternativo, la mutación de Asn229 en Ala (N229A) en el bolsillo de unión del mi. coli Se encontró que MetQ disminuía sustancialmente la afinidad por la metionina, facilitando así en gran medida la preparación de la forma de MetQ sin sustrato. A pesar de los grandes esfuerzos realizados con ambos enfoques, no pudimos cristalizar la forma libre de sustrato de mi. coli MetQ. Mientras examinamos las MetQ caracterizadas estructuralmente del banco de datos de proteínas RCSB, pudimos preparar y cristalizar una forma libre de sustrato de la norte. meningitis MetQ (PDB 3IR1 14), que contiene la mutación Asn a Ala en el residuo 238 (N238A correspondiente a N229A del mi. coli MetQ) para interrumpir la unión del sustrato. Como este residuo de asparagina interactúa con los grupos α-amino y α-carboxilo de la l-metionina, se esperaría que la mutación a alanina perjudicara significativamente la unión del ligando. De hecho, los estudios de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) de la unión del ligando a las formas de tipo salvaje y N238A de norte. meningitis MetQ cuantifica el impacto de esta mutación en la unión de l-metionina, con la constante de disociación (KD) cambiando en un factor de más de 10 5, de 0,2 nM a 78 μM, la unión de la d-metionina también se ve afectada, pero en menor medida a medida que la KD cambia de 3,5 a 240 μM (Figura 1 y Tabla 1).

Proteínas Ligandos KD (μM) ΔH (kJ mol −1) Fracción incompetentea a La fracción incompetente es la fracción de MetQ que aparentemente no puede unirse al titulante.
Tipo salvaje l-metionina 0,00020 [0,00017, 0,00034] b B Aproximadamente el 68,3% de los intervalos de confianza determinados por la proyección de superficie de error 18 se muestran entre corchetes.
−83 [−84, −81] 0.06 [0.049–0.067] b B Aproximadamente el 68,3% de los intervalos de confianza determinados por la proyección de superficie de error 18 se muestran entre corchetes.
Tipo salvaje d-metionina 3.5 [2.5, 4.6] −55 [−57, −53] 0.06 [0.049–0.067] b B Aproximadamente el 68,3% de los intervalos de confianza determinados por la proyección de superficie de error 18 se muestran entre corchetes.
N238A l-metionina 78 [69, 89] −42 [−50, −37] 0.04 [0, 0.067] b B Aproximadamente el 68,3% de los intervalos de confianza determinados por la proyección de superficie de error 18 se muestran entre corchetes.
N238A d-metionina 240 [190, 310] −31 [−34, −29] 0,31 [0,28–0,34] b B Aproximadamente el 68,3% de los intervalos de confianza determinados por la proyección de superficie de error 18 se muestran entre corchetes.
  • Abreviatura: ITC, calorimetría de titulación isotérmica.
  • a La fracción incompetente es la fracción de MetQ que aparentemente no puede unirse al titulante.
  • B Aproximadamente el 68,3% de los intervalos de confianza determinados por la proyección de superficie de error 18 se muestran entre corchetes.

La estructura cristalina de N238A MetQ sin sustrato se determinó a una resolución de 1,56 å (Figura 2a, PDB 6CVA) y revela una conformación abierta con una cavidad de sustrato accesible. La superposición de un dominio de MetQ unido a l-metionina (PDB: 3IR1) en el dominio correspondiente de MetQ N238A sin sustrato revela una rotación de tipo bisagra de 42 ° que separa los dos dominios SBP y abre la cavidad de unión al sustrato (Figura 2b). Este movimiento de bisagra de la “trampa de la mosca Venus” contrasta con el observado para la relación entre MetQ ligado y MetQ libre de sustrato en el complejo MetNIQ, que están relacionados por un giro de 24 ° alrededor de un eje perpendicular a la interfaz entre los dos lóbulos. 7 La desviación cuadrática media (rmsd) en las posiciones Cα entre el N238A sin sustrato y la forma unida a l-metionina de norte. meningitidis MetQ es 3,7 å, mientras que el rmsd correspondiente entre las dos formas sin sustrato de MetQ (N238A y la conformación de MetQ en el complejo con MetNI, PDB 6CVL) es 4,4 å.

MetQ puede unirse a otros derivados de metionina, incluida la d-metionina, pero la preparación de estas formas se ha complicado por la alta afinidad por la l-metionina. Por ejemplo, Yang et al 14 realizaron un esfuerzo previo para cristalizar MetQ unido a d-metionina mediante el cultivo de un auxótrofo de metionina mi. coli Cepa B384 en el medio que contiene 50 mg L -1 de d-metionina. Debido a la presencia de racemasas de aminoácidos en mi. coli, sin embargo, obtuvieron la estructura unida de l-metionina. 14 Por tanto, para cristalizar la d-metionina unida norte. meningitis MetQ, desarrollamos un enfoque alternativo desplegando / replegando MetQ durante la purificación de MetQ para eliminar la l-metionina unida endógena. A continuación, se mezcló una muestra de MetQ desplegada / replegada con d-metionina 10 mM antes de la cristalización. La estructura cristalina de MetQ unida a d-metionina se resolvió a una resolución de 1,68 å con una densidad clara de d-metionina en la cavidad de unión (Tabla 2, PDB 6DZX). Seis moléculas están presentes en la unidad asimétrica del cristal de MetQ unido a d-metionina. Como control, también determinamos la estructura de la l-metionina unida norte. meningitis MetQ cristalizó en condiciones similares (Tabla 2, PDB 6OJA). La superposición de las estructuras de MetQ unidas a l - y d - metionina revela su conformación similar, con rmsd ∼0,1 å (Figura 3a). Si bien estas estructuras son similares a la estructura 3IR1 previamente determinada, 14 rmsd ∼0.4 å, los grupos espaciales y las interacciones de empaquetamiento son distintos en estos dos estudios.

No es sorprendente que la 1 y la d-metionina se unan al mismo sitio, interactuando con el mismo conjunto de residuos conservados. Esta observación es consistente en las seis moléculas de MetQ presentes en la unidad asimétrica. Los grupos α-amino y α-carboxilo tanto de la l como de la d-metionina interactúan con los residuos R156, N213 y N238 ubicados en un dominio de MetQ, mientras que en el otro lóbulo, los residuos Y81, F98, H100 e Y103 se agrupan alrededor el grupo de tioéter de metionina (Figura 3b). Estos residuos de unión están muy conservados entre diferentes homólogos de MetQ bacterianos. 11-14 Los enlaces de hidrógeno entre la cadena lateral N238 y los grupos α-amino y α-carboxilo de la metionina parecen contribuir significativamente a la afinidad de unión, ya que la mutación de este residuo a alanina debilita la unión de l-metionina en más de 10 5. A pesar de unirse al mismo sitio en MetQ, las interacciones detalladas para d - y l-metionina difieren como se refleja en la diferencia de ∼10 4 veces mayor KD valores. El origen de esta diferencia en la afinidad de unión es difícil de identificar, ya que la red de enlaces de hidrógeno que involucra a los grupos α-amino y α-carboxilo no ha cambiado en gran medida entre las dos estructuras, incluida la posición de las moléculas de agua (Figura 3c). Se observan contactos cortos con el grupo CB de metionina en ambas estructuras, con distancias de ∼3,3 å observadas al CO Y98 en la estructura de l-metionina, y a los grupos OH Y81 en la estructura de d-metionina. Las cadenas laterales de 1 - y d - metionina adoptan distintas conformaciones rotámeras para los ángulos de torsión N-Cα-Cβ-Cγ Cα-Cβ-Cγ-Sδ y Cβ-Cγ-Sδ-Cε, que son aproximadamente −175 °, −175 ° y −70 ° para l-metionina y + 170 °, −80 ° y −60 ° para d -metionina, estos últimos valores corresponden a −170 °, + 80 ° y + 60 °, respectivamente, para l - metionina. Por lo tanto, mientras que la l - y la d - metionina exhiben rotámeros "ttm" y "tpp" distintos, estos rotámeros se encuentran en abundancias comparables en proteínas (∼6% cada 19), lo que sugiere que la conformación del ángulo de torsión de la cadena lateral no contribuye significativamente a las diferencias en la afinidad de unión (como referencia, el rotámero de metionina más común es "mmm" con una frecuencia del 20%). En consecuencia, aunque existen diferencias en los detalles de las interacciones de unión entre la 1 y la d-metionina a NmMetQ, una evaluación cualitativa no identifica ninguna característica obvia que domine las diferencias en las afinidades de unión para estos dos ligandos.

La mayor afinidad de MetNI unido a ATP por MetQ sin ligando no es sorprendente dada la alta afinidad de MetQ por l-metionina (se co-purifican) y la necesidad de disociar el ligando de MetQ para que se produzca el transporte.

Hasta la fecha se han caracterizado tres estados conformacionales distintos para MetQ: una forma ligada y dos libres de ligando. Los hallazgos de un estudio FRET de una sola molécula reciente que ilustra la riqueza conformacional de las SBP y el papel de la dinámica conformacional en el transporte de sustrato, 20 sugieren que se pueden identificar conformaciones adicionales de MetQ, quizás para derivados de metionina más grandes con grupos amino o carboxilo modificados, 1 -4 o en complejos con diferentes estados del transportador MetNI. Este estudio proporciona una base para abordar el acoplamiento entre la conformación de MetQ, las afinidades de MetQ por MetNI y derivados de metionina que está en el corazón de la especificidad del transporte de ligando por el transportador de metionina, un paso siguiente importante es definir la cinética de estos interacciones y descifrar cómo se acopla la hidrólisis de MgATP a la translocación del ligando.


Agradecimientos

Agradecemos a S. R. Adams y J. Babendure por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud a R.Y.T. y una beca postdoctoral para A.Y.T, una subvención de Alliance for Cellular Signalling (para J.Z. y R.Y.T.) y el Instituto Médico Howard Hughes. J.Z. cuenta con el apoyo en parte de una beca postdoctoral de La Jolla Interfaces in Science y Burroughs Wellcome Fund, y R.E.C. cuenta con el apoyo en parte de una beca postdoctoral de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud.


Fig. 3

(a) Excitación y (b) emisión de anisotropías en estado estacionario de Cerulean. El alto valor de anisotropía de emisión, & gt 0,3, sugiere una flexibilidad limitada del fluoróforo dentro de la estructura de la proteína. La rápida disminución de la anisotropía de excitación es consistente con FRET entre los aminoácidos aromáticos y el cromóforo de la proteína fluorescente.


Capítulo 6 - Sondas codificadas genéticamente para la medición del calcio intracelular

Las moléculas pequeñas, fluorescentes y sensibles al calcio han sido enormemente útiles para cartografiar las señales de calcio intracelular en el tiempo y el espacio, como atestiguan los capítulos de este volumen. A pesar de su adopción y utilidad generalizadas, sufren algunas desventajas. Son deseables sensores de calcio codificados genéticamente que puedan expresarse dentro de las células mediante transfección o transgénesis. Los últimos 10 años han estado marcados por una rápida evolución en el laboratorio de los sensores de calcio codificados genéticamente, tanto figurativa como literalmente, lo que ha dado como resultado 11 configuraciones distintas de proteínas fluorescentes y sus correspondientes módulos sensores de calcio. Aquí, la lógica de diseño y el rendimiento de esta abundante colección de sensores y sus in vitro y en vivo se describen el uso y el rendimiento. Los sensores de calcio codificados genéticamente han demostrado ser valiosos en la medición de la concentración de calcio en orgánulos celulares, en su mayor parte en células individuales. in vitro. Su éxito como sensores cuantitativos de calcio en tejidos in vitro y en vivo está calificado, pero han demostrado ser valiosos para obtener imágenes del patrón de señales de calcio dentro de los tejidos en animales completos. Algunas ramas del árbol evolutivo del sensor de calcio continúan evolucionando rápidamente y el progreso constante en la optimización de los parámetros del sensor lleva a la esperanza cierta de que estos inconvenientes eventualmente se superarán mediante una mayor ingeniería genética.


Abstracto

Las enzimas desubiquitinantes (DUB) son proteasas que cumplen funciones cruciales en el sistema de ubiquitina (Ub), mediante la desconjugación de Ub de sus objetivos y el desmontaje de cadenas poliUb. La especificidad de un DUB hacia uno de los enlaces de la cadena polyUb determina en gran medida la función de señalización final. Presentamos un nuevo conjunto de sondas FRET de diubiquitina, que comprende los siete enlaces isopéptidos, para la cuantificación absoluta de la especificidad de escisión de la cadena de DUB mediante la cinética de Michaelis & # x02013Menten. Cada sonda está equipada con un par FRET que consta de rodamina110 y tetrametilrodamina para permitir la preparación completamente sintética de las sondas mediante SPPS y NCL. Nuestra estrategia sintética incluye la introducción de norte,N & # x02032& # x02010Boc & # x02010 protegió a 5 & # x02010carboxirodamina como un bloque de construcción conveniente en la química de péptidos. Demostramos el valor de nuestras sondas cuantificando las especificidades de enlace de un panel de nueve DUB de una manera de alto rendimiento.

La ubiquitina (Ub), una proteína de 76 aminoácidos, es un modificador postraduccional que es crucial para una amplia gama de procesos celulares, incluida la degradación, el tráfico y la señalización de proteínas. amina de cadena lateral de un residuo de lisina en la proteína diana, formando así un enlace isopéptido. Las proteínas diana se modifican con frecuencia con una cadena poliUb, en la que múltiples módulos Ub se enlazan sucesivamente en el extremo N & # x02005 (poliUb lineal) o en cualquiera de los siete residuos internos de lisina (isopéptido & # x02010 poliUb enlazado: K6, K11, K27, K29, K33 , K48 y K63). El tipo de cadena polyUb determina en gran medida su función de señalización.

La ubiquitinación está mediada por la acción concertada de tres enzimas, E1 (activante), E2 (conjugadora) y E3 (ligasa), cuya combinación particular proporciona especificidad para la proteína diana o topología de la cadena poliUb. La eliminación de Ub de sus objetivos y el desmontaje de las cadenas poliUb se catalizan mediante enzimas deubiquitinantes (DUB). Se han identificado alrededor de 100 DUB humanos2 algunos exhiben especificidad de enlace Ub. La acción de DUB puede rescatar proteínas de la degradación proteasomal y alterar las funciones de señalización de Ub a través de la remodelación de la cadena de una manera específica de ligamiento.1 La síntesis de diubiquitina (diUb) ha hecho posible estudiar el procesamiento por DUBs.3 Para determinar la especificidad, un DUB se puede incubar con una molécula nativa de diUb4 o con una actividad diUb & # x02010 basada en una sonda5 de un enlace dado. Sin embargo, los métodos actuales no permiten una cuantificación rápida y absoluta de la especificidad del enlace DUB y, además, no pueden separar esta especificidad en afinidad de unión y tasa de renovación catalítica (K metro y k gato, respectivamente, en la cinética de Michaelis & # x02013Menten).

La aplicación de pares FRET ha demostrado ser útil en el estudio de la actividad DUB, la conformación de la cadena Ub y las proteínas que interactúan con Ub6. pares de FRET diUb. Estos pares llevan un nuevo tinte & # x02010pair adecuado para FRET y compatible con la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). Determinamos K metro y k gato valores de enlace y DUB específicos que se utilizan en el análisis de restricción de la cadena Ub, 7 con el fin de obtener información sobre su acción catalítica.

En el ensayo basado en FRET & # x02010 (Figura & # x02005 1) los reactivos consisten en dos módulos Ub, uno equipado con un fluoróforo donante y el otro con un aceptor, estos están específicamente unidos por un enlace isopéptido nativo a cada uno de los siete residuos de lisina. Razonamos que la mejor posición para la fijación del fluoróforo sería el N & # x02005termini de ambos módulos Ub, porque la distancia entre el N & # x02005termini varía de 30 a 50 & # x02005 & # x000c5, según los datos cristalográficos disponibles (Tabla & # x02005S1 en el Información), una distancia ideal para FRET. Debido a que los fluoróforos deben ser compatibles con todos los pasos sintéticos (ver más abajo), desarrollamos un nuevo par FRET usando 5 & # x02010carboxirodamina110 (Rho) como donante y 5 & # x02010carboxitetrametilrodamina (TAMRA) como aceptor. La fluoresceína, el donante de FRET más comúnmente utilizado, se probó inicialmente pero resultó incompatible con el paso de desulfuración en el paso de síntesis final (ver más abajo) y por lo tanto fue reemplazado por Rho. Tras la adición de un DUB, el par diUb FRET se escinde, lo que da como resultado la pérdida de la señal FRET y, por lo tanto, un aumento en la emisión del donante.

Principio del ensayo de escisión de diUb basado en FRET & # x02010. Tras la escisión del par diUb FRET mediante un DUB, se pierde la señal FRET.

Un problema importante en el uso de Rho (pero también TAMRA) en SPPS (Esquema & # x02005 1 & # x02009A) es que cuando Rho se une a una amina en un péptido globalmente protegido, la mitad carboxilato 1 & # x02010 de Rho está en una conformación abierta y puede reaccionar tras una mayor extensión de la cadena peptídica (Esquema & # x02005 1 & # x02009A, 1& # x021922). Además, el acoplamiento de Rho es generalmente difícil debido a la escasa solubilidad y reactividad intrínseca de los restos de anilina. Por lo tanto, preparamos N, N & # x02032& # x02010Boc & # x02010 protegido Rho. Cuando esta molécula se acopla a un péptido, la protección doble de Boc bloquea el 1 & # x02010carboxilato en la forma de lactona cerrada, por lo que no reacciona (Esquema & # x02005 1 & # x02009A, 3& # x021924). Modificamos el método informado por Grimm y Lavis8 para preparar norte,N & # x02032& # x02010Boc & # x02010 protegido Rho 10 (Esquema & # x02005 1). 5 & ​​# x02010 Carboxifluoresceína (5) se convirtió en cuatro pasos en ditriflato 8. Buchwald & # x02013 Acoplamiento Hartwig con BocNH2 resultó en la formación de norte,N & # x02032& # x02010Boc & # x02010 protegido Rho (9). El uso de la protección del éster etílico del 5 & # x02010carboxilato permitió la liberación selectiva del 5 & # x02010carboxilato sin afectar a los grupos Boc, lo que resultó en 10. En contraste con Rho desprotegido, 10 es muy soluble en disolventes orgánicos, se puede acoplar fácilmente en condiciones estándar de acoplamiento de péptidos y se puede preparar en una escala de varios gramos.

Los siete pares de FRET diUb 17 & # x02009a& # x02013gramo fueron construidos por ligadura química nativa (NCL) entre Rho & # x02010Ub & # x02010thioester 14 y TAMRA & # x02010Ub que contiene un bloque de construcción & # x003b3 & # x02010thioLys3, 9 16 (Esquema & # x02005 2). Los módulos de Ub individuales fueron sintetizados por SPPS lineal en resina de tritilo hiper & # x02010 & # x02010labile.3 DiBoc & # x02010protected Rho (10) estaba acoplado a Ub1 & # x0221275 (11) sobre resina para dar como resultado 12, que posteriormente se separó de la resina en condiciones ácidas suaves sin afectar el esquema de protección global. Se acopló propionato de metilo & # x020103 & # x02010 (gliciltio) & # x02010 al carboxilato terminal de C & # x02010 liberado para dar 13. La desprotección global en condiciones ácidas fuertes seguida de intercambio catiónico y purificación por RP & # x02010HPLC dio el tioéster Rho & # x02010Ub & # x02010 14. Es de destacar que los grupos Boc en Rho se eliminan concomitantemente durante la desprotección global, restaurando así sus propiedades fluorescentes. Módulos TAMRA & # x02010Ub que contienen & # x003b3 & # x02010thioLys en cada una de las respectivas posiciones de lisina (16 & # x02009a& # x02013gramo) se prepararon acoplando el isómero carboxi 5 & # x02010 de TAMRA al Ub1 & # x0201376 polipéptidos 15 & # x02009a& # x02013gramo, seguido de desprotección y purificación global (Figura & # x02005S1 en la Información complementaria). La metionina & # x020101 fue reemplazada por la norleucina isóstera para prevenir la oxidación del resto tioéter. Reacciones NCL entre 14 y 16 & # x02009a& # x02013gramo, seguido de desulfuración en condiciones de radicales, 10 purificación por RP & # x02010HPLC y filtración en gel dieron los siete pares de FRET diUb finales 17 & # x02009a& # x02013gramo en buen rendimiento y pureza.

Las purezas de 17 & # x02009a& # x02013gramo fueron confirmados por análisis LCMS (Figura & # x02005 2 & # x02009A, B, e información de apoyo) y análisis de gel (Figura & # x02005 2 & # x02009C). Upon excitation at 466 nm, the emission spectra of the diUb FRET pairs and Rho‐Ub and TAMRA‐Ub revealed that all seven molecules show a clear FRET signal (Figure  2 𠂝). We performed fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to determine FRET efficiencies of all the FRET pairs (Figure  2 𠂞, Table S3) these were found to be 0.45𠄰.60, depending on the linkage, thus demonstrating efficient FRET in all these molecules.

Characterization of diUb FRET pairs 17𠂚& # x02013gramo. A)𠁚nalytical HPLC and B) MS of Lys6‐linked diUb FRET pair 17𠂚. C) SDS‐PAGE analysis. D)𠁞mission spectra recorded at λ ex=466 nm. E)𠁟RET efficiencies (mi) determined by FLIM.

DUB‐mediated cleavage of our new diUb FRET pairs was first assessed by incubation with USP7 and OTUD2, two well‐studied DUBs from the two largest DUB families and for which cleavage of unlabeled diUbs has been reported. Reactions were analyzed by SDS‐PAGE (Figures S2 and S3) which showed that the diUb selectivity of both DUBs was in good agreement with reported data.4a,4b We then incubated OTUD2 with Lys11‐ and Lys27‐linked diUb FRET pairs (17𠂛 y 17𠂜, respectively) and the corresponding unlabeled diUbs. We also included a 1:1 mixture of the FRET pair and the unlabeled diUb for both linkages. SDS‐PAGE analysis (Figures  3 𠂚, S4 and S5) showed that both the FRET pair and the unlabeled diUb substrates were equally processed, thus we concluded that the attached fluorophores do not affect DUB activity.

A) SDS‐PAGE analysis of Lys11‐linked diUb cleavage. OTUD2 was incubated with unlabeled diUb, FRET pair 17𠂛, or a 1:1 mixture samples were taken after 10, 30, 60, and 180 min. B) Michaelis–Menten kinetics of TRABID for Lys29‐, Lys33‐ and Lys63‐linked diUb, as determined by the FRET assay.

We next applied our FRET reagents for the quantification of diUb linkage‐specificity for nine DUBs derived from three different DUB families each was shown to display a distinct specificity (Table  1 ).4b We incubated the DUBs with all diUb FRET pairs at a fixed concentration (0.5 μ m, to keep initial fluorescence constant for all samples) with an increasing concentration of the unlabeled diUb (0� μ m ). The enzyme concentration was chosen such that the reaction proceeded linearly for at least 20 min (Supporting Information). The total amount of processed diUb was then determined by monitoring the increase in donor fluorescence over time from this the rates of initial velocity were calculated and fitted to the Michaelis–Menten equation (Figure  3 𠂛 and Supporting Information), from which K metro y, k gato were determined.

Tabla 1

Kinetic characterization of DUBs that are used in Ub chain restriction analysis7 for the diUb FRET pairs 17𠂚& # x02013gramo. [a]

DUBLinkage K metro [μ m ] k gato [s 𢄡 ] k gato/K metro [ m 𢄡  s 𢄡 ]
AMSHLys63 45.40.002759
AMSH* [b] Lys632.40.1770�
CezanneLys1119.41.578�
OTUB1Lys48n.d.& # x02009
OTUB1* [b] Lys48 38.60.6617�
OTUD1Lys63n.d.4020
OTUD3Lys6n.d.& # x02009
& # x02009Lys11 52.40.0085162
& # x02009Lys63 57.90.0061105
TRABIDLys29 40.10.0531317
& # x02009Lys3319.60.0281431
& # x02009Lys63 54.00.034627
OTUD2Lys11 87.94.450�
& # x02009Lys27n.d.& # x02009
& # x02009Lys29n.d.& # x02009
vOTULys63.60.87242�
& # x02009Lys113.40.2263�
& # x02009Lys488.41.0119�
& # x02009Lys631.40.09166�
USP21Lys62.10.1260�
& # x02009Lys111.40.08762�
& # x02009Lys332.10.1360�
& # x02009Lys481.70.06739�
& # x02009Lys632.70.1660�

[a] Values in italics were obtained by extrapolation beyond the highest substrate concentration. [b]�tivated versions of AMSH and OTUB1 were created by fusing them to their activators (STAM and UBE2D2, respectively).11

Table  1 shows the data for all combinations of DUB and diUb substrate for which activity could be measured. Overall, the individual diUb linkage types cleaved by each DUB were consistent with published qualitative data.4 As expected from earlier findings, the unspecific DUB USP21 showed similar activity towards most linkages.4a The virus�rived DUB vOTU, which is also considered to be unspecific, showed some interesting results: the catalytic efficiency (k gato/K metro ) for Lys6 was two times higher than for Lys48, and four times higher than for Lys11 and Lys63 diUbs this can largely be attributed to differences in k gato en vez de K metro . Another interesting result was for AMSH. In agreement with earlier findings, this DUB had absolute specificity for Lys63 diUb,4c although the overall efficiency was rather low. Remarkably, the recently reported fusion of AMSH with its natural activator STAM211 resulted in a more than 1000𠄏old increase in catalytic efficiency, which can be attributed to increases in both affinity and catalytic turnover. Taken together, these data show that our quantitative assessment of the DUB linkage specificity is in accordance with reported data and that new insights can be obtained from the kinetic parameters.

In summary, the set of all seven isopeptide‐linked diUb FRET pairs allows absolute quantification of DUB linkage specificity. Our synthetic strategy, which includes a convenient norte,N & # x02032𠄋oc‐protected Rho building block, allows efficient preparation of these reagents in large quantities. The assay requires low amounts of material, can easily be automated, and can be used in high‐throughput small‐molecule screening or for the assessment of (di)Ub binding domains.6c Overall, we believe that our diUb FRET probes will be of great value in ongoing efforts to crack the ubiquitin code and that the FRET pair presented here will facilitate FRET‐pair synthesis in general.


Resumen del autor

There is abundant evidence that insufficient energy, or energy failure, contributes to the pathophysiology of many inherited and degenerative diseases, cancer, and aging. However, we understand little about how cellular energy levels are regulated. To begin to address this gap, we developed a screening approach that uses a fluorescent biosensor to measure relative levels of ATP in individual cells and used this approach to identify those genes that are most essential to maintaining energy levels. We screened approximately 2,200 genes and found that mitochondrial ribosomal proteins are particularly critical in maintaining energy levels and enabling cell growth. We also used this approach to identify genetic targets that could be amenable to an energy-based therapy via supplementation with the mitochondrial cofactor coenzyme Q10 (CoQ10). These included CoQ10 biosynthetic genes associated with human disease as well as a subset of genes not previously linked to CoQ10 biosynthesis. Our screening paradigm thus reveals mechanisms by which cellular energy levels are controlled. It can also be used to identify genetic defects that will be responsive to energy-based therapies. Application of this approach may additionally enable powerful screens for other key metabolites to further advance a genome-scale understanding of the regulation of metabolism.

Citación: Mendelsohn BA, Bennett NK, Darch MA, Yu K, Nguyen MK, Pucciarelli D, et al. (2018) A high-throughput screen of real-time ATP levels in individual cells reveals mechanisms of energy failure. PLoS Biol 16(8): e2004624. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004624

Editor académico: Rong Tian, University of Washington, United States of America

Recibió: October 30, 2017 Aceptado: July 26, 2018 Publicado: August 27, 2018

Derechos de autor: © 2018 Mendelsohn et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del documento y sus archivos de información de respaldo. Specifically, S1 Table contains screen data for all genes in all conditions.

Fondos: Joan and David Traitel Family Trust. KN, BAM, NKB, MAD, KY, MKN, and MN. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Betty Brown’s Family. KN, BAM, NKB, MAD, KY, MKN, and MN. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Hagar Family Foundation. JLN and DP. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Burroughs Wellcome Fund Medical Scientist Career Award. KN, BAM, MAD, and KY. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Pediatric Scientist Development Program (grant number K12-HD000850). BAM. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. NIH (grant number R01 NS091902, 5P30 NS069496, U54CA196519, R01 DA036858, U01 CA168370, DP2 GM119139, RR018928, S10-RR028962, K99/R00 CA204602). R01 NS091902: KN, 5P30 NS069496: KN, BAM, NKB, MAD, KY, MKN, and MN, U54CA196519: JLN, R01 DA036858: LG, MAH, and MK, U01 CA168370: LG, MAH, and MK, DP2 GM119139: MK, S10-RR028962: Gladstone flow cytometry core: LG, K99/R00 CA204602. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. St. Baldrick’s Scholar Award. JLN and DP. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Howard Hughes Medical Institute. LG, MH, and MK. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. CFAR grant (grant number P30-AI-027763). Gladstone flow cytometry core. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. James B. Pendelton Charitable Trust. Gladstone flow cytometry core. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.

Abreviaturas: 2DG, 2-deoxyglucose ATPbasal, ATP levels under basal conditions ATPgly, ATP levels under glycolytic conditions ATPresp, ATP levels under respiratory conditons CFP, cyan fluorescent protein CoQ10, coenzyme Q10 COS, CV-1 (simian) in origin, and carrying the SV40 genetic material CRISPRi, clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference dCas9, dead CRISPR-associated protein 9 ECAR, extracellular acidification rate FACS, fluorescence-activated cell sorting FBS, fetal bovine serum FCCP, carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone FRET, fluorescence resonance energy transfer GROWTHbasal, growth under basal conditions GROWTHglyc, growth under glycolytic conditions GROWTHresp, growth under respiratory conditions HGNC, HUGO Gene Nomenclature Committee HPLC, high-performance liquid chromatography KRAB, Kruppel-associated box MELAS, mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes MICOS, mitochondrial contact site and cristae organizing system mVenus, monomeric Venus NDUFS4, NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit S4 OCR, oxygen consumption rate PVDF, polyvinylidene fluoride qRT-PCR, quantitative real-time reverse transcription PCR RNAi, RNA interference ROS, reactive oxygen species sgRNA, single guide RNA shRNA, short hairpin RNA TCA, tricarboxylic acid Tom20, translocase of outer membrane 20 kDa subunit


Información del autor

Matthew Y. Tang and Marta Vranas: These authors contributed equally to this work

Afiliaciones

Department of Neurology and Neurosurgery, McGill Parkinson Program, Neurodegenerative Diseases Group, Montreal Neurological Institute, McGill University, Montréal, Québec, Canada H3A 2B4

Matthew Y. Tang, Andrea I. Krahn, Shayal Pundlik & Edward A. Fon

Department of Pharmacology and Therapeutics, Groupe de Recherche Axé sur la Structure des Protéines, McGill University, Montréal, Québec, Canada H3G 1Y6


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Comentarios:

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