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¿En qué se diferencia la bacteriorrodopsina de la rodopsina presente en los ojos de los mamíferos?

¿En qué se diferencia la bacteriorrodopsina de la rodopsina presente en los ojos de los mamíferos?


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En mi libro de texto de la escuela secundaria, está escrito que son similares. Entonces, solo tenía curiosidad por saber sobre esto. Gracias.


Aunque son similares tanto en bacteriorrodopsinas como en rodopsinas, son proteínas de unión a la retina, la similitud en su secuencia de aminoácidos es muy limitada.

La diferencia clave entre ellos es que la rodopsina es un receptor acoplado a proteína G, y este no es el caso de la bacteriorrodopsina. Una búsqueda rápida en Google en Bacteriorrodopsina frente a rodopsina le enviará a un artículo de Wikipedia que dice:

La bacteriorrodopsina pertenece a la rodopsinas microbianas. Tienen similitudes con las rodopsinas de los vertebrados, los pigmentos que detectan la luz en la retina. Las rodopsinas también contienen retina; sin embargo, las funciones de la rodopsina y la bacteriorrodopsina son diferentes y existe una similitud limitada en sus secuencias de aminoácidos. Ambos rodopsina y bacteriorrodopsina pertenecen a la Receptor 7TM familia de proteínas, pero la rodopsina es un receptor acoplado a proteína G y bacteriorrodopsina no es.

Un muy buen artículo si desea saber más sobre los dos es el H. Gobind Khorana sobre el Dos proteínas de membrana transductoras de luz.


La relación evolutiva entre las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias.

La rodopsina es una clase de proteínas cuyas características comunes son una apoproteína de hélice alfa de siete transmembranas y un cofactor de la retina [1, 2]. La retina funciona como cromóforo de rodopsina que es responsable de la absorción de luz. Se une de forma reversible y covalente a una lisina en la séptima hélice de la apoproteína. Por así decirlo, la parte proteica de la rodopsina es su base estructural, mientras que la retina es la columna vertebral funcional de la rodopsina. Las rodopsinas se encuentran de forma ubicua en tres dominios de la vida: arqueas, eubacterias y eucariotas [3-7]. Según sus secuencias de proteínas, las rodopsinas se pueden clasificar en dos grupos: las rodopsinas de tipo 1 y las rodopsinas de tipo 2 [2]. Las rodopsinas de tipo 1 existen en organismos unicelulares, mientras que las rodopsinas de tipo 2 solo aparecen en animales multicelulares. Por conveniencia, llamamos rodopsinas microbianas tipo 1 rodopsinas y rodopsinas tipo 2 metazoos rodopsinas en este estudio. Las rodopsinas microbianas funcionan como receptores de fototaxis (rodopsina sensorial), transportadores de iones de cloruro o protones impulsados ​​por la luz (bacteriorrodopsina y halorhodopsina) [2, 3, 5, 6, 8]. Las rodopsinas metazoarias funcionan principalmente como receptores visuales en los ojos de los animales, como las opsinas de varilla o cono [9-11]. Al igual que las rodopsinas microbianas, las rodopsinas metazoarias también realizan funciones no sensoriales. La melanopsina, expresada en el cerebro y los ojos, puede estar implicada en los ritmos circadianos y el reflejo papilar [12]. La neuropsina (Opn5) se expresa predominantemente en tejidos neurales [13]. La encefalopsina se expresa en el cerebro y los órganos viscerales [14]. La opsina RGR, expresada en el epitelio pigmentario de la retina (RPE) y las células de Muller, funciona como la fotoisomerasa [15, 16]. La peropsina se expresa en las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) [17]. Hasta ahora, los investigadores han identificado nueve subgrupos de opsinas no visuales en Metazoa [1821].

La relación evolutiva entre las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias es difícil de decidir, porque no muestran una identidad claramente detectable a nivel de secuencia. Aunque la falta de identidad de secuencia no puede utilizarse para demostrar que no son proteínas homólogas, la identidad de secuencia es la piedra angular del conocimiento convencional de la homología de proteínas [22]. Debido a la divergencia evolutiva, la identidad de secuencia en diferentes proteínas homólogas disminuye con el tiempo. Nuestra capacidad para detectar homología de secuencia en proteínas relacionadas depende de su tasa de divergencia y distancia evolutiva [23]. Usando la matriz PAM, Dayhoff et al. muestran que la limitación de la identidad de secuencia para deducir la homología de proteínas es de alrededor del 20% de identidad [23]. Si dos proteínas comparten menos del 20% de identidad de secuencia, significa que no son proteínas homólogas o que su origen común se borra en la evolución.

Hay dos escenarios evolutivos posibles para las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias: (1) usar retinal como cromóforo, unir retinal con una lisina y un dominio similar de siete transmembranas son el resultado de la evolución convergente (2) sus características comunes son el legado de un común ancestro, sin embargo, su identidad de secuencia es apenas detectable debido a la divergencia rápida y / o prolongada.

Para investigar la relación evolutiva entre las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias, tenemos que evitar el problema de la falta de similitud de secuencia. Fitch desarrolló un método estadístico para distinguir las proteínas homólogas de las no homólogas [24]. Su método compara el estado ancestral de un grupo de proteínas con el estado ancestral de otro. Evita la necesidad de identidad de secuencia para decidir la relación evolutiva entre dos grupos de proteínas. En este estudio, usamos su método para probar si las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias son proteínas homólogas o no.

2.1. Estructura de datos. Una búsqueda directa en la base de datos de PDB arrojó dos rodospinas de metazoos y cinco rodopsinas microbianas con datos de estructura (Tabla 1).

2.2. Datos de secuencia. Las secuencias de proteínas del genoma completo y las secuencias de ADNc correspondientes para veintisiete especies de metazoos se descargaron de la base de datos Ensembl, la base de datos NCBI y VectorBase [25]. Estas especies cubren siete filos: Porifera, Cnidaria, Nematoda, Arthropoda, Chordata, Hemichordata y Echinodermata. La especie en Chordata también representó clases importantes en este filo. Usamos un script en Perl para extraer las transcripciones más largas de cada genoma en este estudio.

2.3. BLAST y FASTA buscan genes de rodopsina en los datos del genoma. Utilizamos BLAST para buscar genes de rodopsina en genomas microbianos [26]. Utilizando cinco rodopsinas microbianas con datos de estructura como consultas, buscamos en la base de datos completa del genoma microbiano, la base de datos del genoma de los hongos y la base de datos del genoma de las algas verdes en el sitio web del NCBI. Los parámetros de BLAST se establecieron de la siguiente manera: las secuencias objetivo máximas fueron 500, el umbral esperado fue 0,001 y los demás fueron predeterminados.

Utilizamos FASTA 3.5 para buscar genes de rodopsina en cada genoma de metazoos [27]. Dos rodopsinas metazoarias con datos de estructura sirvieron como consultas. El valor E para la búsqueda FASTA se estableció en 0,001.

Los resultados de búsqueda en BLAST o FASTA se alinearon con las secuencias de consulta utilizando MUSCLE con los parámetros predeterminados [28]. Los aciertos se identificaron como candidatos a rodopsinas solo cuando comparten una lisina conservada de unión a la retina en la séptima hélice en la misma posición que las consultas. Eliminamos los resultados candidatos redundantes y cualquier secuencia de menos de 200 aminoácidos o de más de 1000 aminoácidos.

2.4. Alineación de estructuras. Utilizando sus archivos PBD, dos estructuras de proteínas de metazoos rhodospin y cinco estructuras de proteínas microbianas de rodopsina se alinearon con el servidor de alineación de estructuras de proteínas múltiples CE-MC con parámetros predeterminados [29].

2.5. Alineación de secuencia. Las secuencias de proteínas de rodopsina microbianas o metazoarias se alinearon utilizando MUSCLE con los parámetros predeterminados [28]. Todas las secuencias de nucleótidos en este estudio se alinearon de acuerdo con su resultado de alineación de secuencias de proteínas.

2.6. Selección de la región de prueba. Aunque no existe una identidad de secuencia claramente detectable, la estructura de la proteína es algo comparable entre las rodopsinas microbianas y metazoarias. La selección de la región de prueba entre las rodopsinas microbianas y metazoarias se basó en la alineación de su estructura. El problema que encontramos aquí es que los datos de estructura son mucho más escasos que los datos de secuencia en ambos grupos de rodopsinas. Solo dos rodospinas de metazoos y cinco rodopsinas microbianas tienen datos de estructura. Entonces, tenemos que usar su alineación de estructura como una guía para inferir el dominio de siete transmembranas en su alineación de secuencia.

Todas las rodopsinas microbianas comparten una homología de secuencia claramente detectable, así como todas las rodopsinas metazoarias, por lo que el resultado de la alineación de secuencias es confiable dentro del grupo microbiano o metazoario. Sin embargo, el resultado de la alineación de la estructura no siempre coincide con el resultado de la alineación de la secuencia, es decir, la homología posicional propuesta por la alineación de la estructura microbiana puede no ser la misma propuesta por la alineación de la secuencia microbiana. Nuestra solución es que primero alineamos todas las secuencias de rhodospin microbianas usando MUSCLE. Luego, seleccionamos cinco secuencias de rodopsina microbiana con datos de estructura en el resultado de la alineación MUSCLE y comparamos su alineación de secuencia con su alineación de estructura. Al hacerlo, pudimos identificar la homología posicional acordada por ambos métodos de alineación. Repetimos esta práctica en las rodopsinas metazoarias utilizando la alineación de la estructura de calamares y rodopsinas bovinas como guía. La región de prueba final es el resultado de la alineación acordado por las alineaciones de estructura y secuencia.

2.7. Análisis filogenético e inferencia de estados ancestrales. Se utilizaron métodos de unión de vecinos, bayesianos y de máxima verosimilitud para construir un árbol filogenético de rodopsinas microbianas o metazoarias. ProtTest se utilizó para seleccionar modelos de evolución para nuestros análisis filogenéticos [30]. MEGA 5 se utilizó para construir el árbol NJ con la opción de "eliminación por pares" y el modelo "JTT" [31]. Las velocidades y los patrones se establecieron como "Gamma distribuido", y el parámetro Gamma se estableció como "4". Se utilizó el método Bootstrap para probar la filogenia, y el número de réplicas de bootstrap se estableció como "500". Se utilizó PhyML 3.0 para construir el árbol ML con el modelo "WAG" [32]. La proporción de sitios invariables y el parámetro de forma gamma se estimaron a partir del resultado de la alineación. Se utilizó una prueba de razón de verosimilitud aproximada para probar la confiabilidad de la rama [33]. MrBayes 3.1.1 se utilizó para construir un árbol bayesiano con el modelo "WAG" [34]. Corrimos durante 500, 000 generaciones y muestreamos árboles de probabilidad posterior cada 1000 generaciones. Resumimos el 25% de los valores de los parámetros y de los árboles para obtener el árbol de consenso.

El paquete PHYLIP se utilizó para construir el árbol Fitch-Margoliash de genes de rodopsina dentro de cada especie de metazoos [35]. El árbol de rodopsina dentro de la especie se construyó con el modelo "JTT" y se probó con 100 réplicas de arranque.

Los árboles filogenéticos sirvieron como historia evolutiva para nuestra inferencia de estado ancestral. El método de la parsimonia se utilizó para inferir estados ancestrales [24]. Escribimos un script en Perl para implementar este método.

2.8. Prueba de parentesco en estados ancestrales. La prueba de parentesco en dos estados ancestrales es un método estadístico que Fitch ideó en su artículo de 1970 [24]. La idea básica detrás de esta prueba es que la probabilidad de parentesco se puede calcular comparando la distancia de mutación observada entre dos estados ancestrales con la distancia de mutación esperada entre ellos. La distancia de mutación observada son las diferencias de nucleótidos reales entre dos estados ancestrales. La distancia de mutación esperada entre dos estados ancestrales es la probabilidad de conjuntos de nucleótidos disjuntos elegidos al azar entre ellos multiplicada por la longitud de su secuencia. La desviación estándar entre dos distancias es la raíz cuadrada de la distancia esperada multiplicada por la probabilidad de conjuntos de nucleótidos intersectantes elegidos al azar entre ellos. El número de desviaciones estándar entre la distancia de mutación observada y la distancia de mutación esperada sigue la distribución normal. La probabilidad de su valor se puede encontrar en la tabla de probabilidad normal y se usa como probabilidad de significancia.

3.1. Homología estructural entre la rodopsina microbiana y la rodopsina metazoaria. La alineación de la estructura de cinco rodopsinas microbianas y dos rhodospins metazoos muestra que todas las rodopsinas comparten una homología estructural notable (Figura 1). Se conservan siete hélices transmembrana dentro de las rodopsinas microbianas o metazoarias y entre ellas.

Aunque no existe una homología de secuencia claramente detectable entre estos dos grupos de rodopsinas, la alineación de la estructura revela que comparten un motivo de secuencia WXXY conservado en la sexta hélice. Curiosamente, la lisina que se une a la retina en el séptimo no se conserva estructuralmente y se ubica en una posición diferente entre ellas. También hay una inserción / deleción / a en la séptima hélice entre estos dos grupos de rodopsinas, que es solo un aminoácido antes de la lisina crucial en las rodopsinas microbianas (inserción) o un aminoácido después de la lisina crucial en las rodopsinas metazoarias (deleción). . Entonces, la posición de la lisina de unión a la retina desplaza tres aminoácidos hacia adelante en las rodopsinas metazoarias.

3.2. Genes de rodopsina en genomas microbianos y metazoarios. La búsqueda BLAST de rodopsinas microbianas regresó con 62 rodopsinas microbianas (consulte la Tabla S1 en el Material complementario disponible en línea en http://dx.doi.org/10.1155/2013/435651). La búsqueda de FASTA de rodopsinas metazoarias regresó con 227 rodopsinas metazoarias de 25 especies (Tabla 2).

En 62 rodopsinas microbianas, treinta y cinco de ellas son de bacterias, veinticuatro son de arqueas y tres son de eucariotas. La bacteria Salinibacter ruber M8 y la arquea Haloarcula marismortui ATCC 43049 tienen cuatro copias diferentes del gen de la rodopsina. Una especie de bacteria y cuatro especies de arqueas tienen tres genes de rodopsina diferentes. Once especies microbianas tienen dos genes de rodopsina diferentes. Entre las tres rodopsinas microbianas eucariotas, dos de ellas son del alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii y una es de la levadura encapsulada Cryptococcus neoformans var. neoformans.

La Tabla 2 muestra el número de genes de rodopsina en cada especie de metazoos. Nombramos genes de rhodospin en orden numérico dentro de cada especie de metazoos. El número de genes de rodopsina varía drásticamente en cada especie de metazoos. En los insectos, el mosquito de la malaria tiene nueve genes de rodopsina, mientras que la blusa corporal solo tiene tres. No se encuentra ningún gen de rodopsina en la esponja Amphimedon queenslandica y el nematodo Caenorhabditis elegans, aunque tienen genes relacionados con la rodopsina.

3.3. Región de prueba final. La región de prueba final que seleccionamos es el resultado de alineación consistente entre las alineaciones de estructura y secuencia. No se encuentra una región consistente en las hélices A, B o D. En la hélice C, hay una región consistente de 18 aminoácidos. En la hélice E, hay dos regiones consistentes: una tiene una longitud de 11 aminoácidos y la otra tiene una longitud de 14 aminoácidos. En la hélice F, hay una región consistente de 25 aminoácidos. En la hélice G, hay una región consistente de 18 aminoácidos. La región de prueba total tiene una longitud de 86 aminoácidos y es igual a 258 nucleótidos.

3.4. La historia evolutiva y la inferencia del estado ancestral en las rodopsinas metazoarias. Usamos tres métodos diferentes para construir árboles filogenéticos para todas las rodopsinas metazoarias en este estudio. Las hidrarodopsinas sirven como un grupo externo para enraizar árboles metazoos. En nuestro estudio, Hydra es el único animal de Cnidaria. Es el filo basal de Arthropoda, Chordata, Hemichordata y Echinodermata. Enraizados con rodopsinas Hydra, tres árboles muestran tres topologías generales diferentes. El árbol de unión de vecinos muestra todos los genes de rodopsina divididos en tres clados principales, excepto Hydra rodopsins (Figura complementaria 1). Un clado consta principalmente de rodopsinas cordados y no rodopsinas artrópodas. Los otros dos clados contienen rodopsinas cordados y artrópodos. El árbol de máxima verosimilitud muestra una historia evolutiva diferente del árbol de NJ (Figura complementaria 2). El árbol ML tiene cuatro clados principales en lugar de tres. El árbol bayesiano muestra una historia evolutiva más complicada (Figura complementaria 3). Tres clados separados en el árbol de Nueva Jersey se mezclan en el árbol bayesiano. No sabíamos qué árbol es el más confiable de los tres árboles. Tres árboles produjeron tres estados ancestrales diferentes. Solo un estado es cierto, porque todas las rodopsinas metazoarias comparten solo una historia evolutiva.

Con el fin de obtener un estado ancestral confiable, construimos el árbol filogenético para las rodopsinas dentro de cada especie de metazoos en lugar de para todas las rodopsinas de los metazoos (Figuras 2 (a) y 2 (b)). Al reducir el número de taxones en la construcción de árboles, podríamos obtener árboles más confiables para la inferencia de estados ancestrales. Sin embargo, al hacerlo, tuvimos que inferir un estado ancestral para cada especie de metazoos. Usando una hidra rodopsina como un grupo externo, construimos 24 árboles de rodopsina metazoos e inferimos 24 estados ancestrales basados ​​en estos árboles. Dieciocho de ellos son posibles estados ancestrales de la rodopsina metazoaria en Chordata. Cuatro de ellos son posibles estados ancestrales en Arthropoda. Dos de ellos son posibles estados ancestrales en Hemichordata y Echinodermata.

3.5. La historia evolutiva y la inferencia del estado ancestral en rodopsinas microbianas. También utilizamos tres métodos diferentes para construir árboles filogenéticos para todas las rodopsinas microbianas. Tres árboles microbianos son consistentes en topologías generales, aunque difieren en la posición de una rama que contiene seis bacterias rodopsinas (Figuras complementarias 4, 5 y 6). El problema es que las bacterias y las arqueas son clados hermanos en la sistemática biológica. Significa que no podemos enraizar árboles microbianos. Si no pudiéramos decidir un grupo externo para los árboles microbianos, no seríamos capaces de inferir ningún estado ancestral con ellos.

Para superar este problema, primero intentamos encontrar qué subárbol microbiano es el árbol candidato más posible para la inferencia de estados ancestrales. Utilizando el método de Fitch, probamos cada gen de rhodospin microbiano existente con 24 estados ancestrales de metazoos. Encontramos que tres rodopsinas microbianas están relacionadas lejanamente con estados ancestrales metazoarios con significación estadística (Tabla complementaria 2). Estas tres rodopsinas están ubicadas en un solo subárbol que contiene 13 rodopsinas microbianas (Figura 3). Luego inferimos todos los posibles estados ancestrales de la rodopsina microbiana en este subárbol.

3.6. La relación entre los estados ancestrales de las rodopsinas microbianas y los estados ancestrales de las rodopsinas metazoarias. Probamos 24 estados ancestrales de la rodopsina metazoaria con todos los estados ancestrales posibles de la rodopsina microbiana en el subárbol candidato. Entre todos los estados ancestrales de la rodopsina microbiana inferidos, un estado ancestral de la rodopsina microbiana tiene la menor distancia de mutación con los estados ancestrales de la rodopsina metazoaria (Figura 3). Este estado ancestral microbiano se reconstruye sobre un hongo rodopsina, una bacteria rodopsina y ocho arqueas rodopsinas. El resultado de la prueba muestra que 13 estados ancestrales de la rodopsina metazoos están relacionados de manera divergente con ella con significación estadística (Tabla 3). Estos estados ancestrales cubren Arthropoda, Chordata, Hemichordata, Echinodermata y dos subphyla en Chordata: Tunicata (ascidia) y Cephalochordata (amphioxus).

4.1. Homología estructural versus origen común. Las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias comparten una homología estructural notable en sus siete hélices (Figura 1).Sin embargo, la homología estructural no indica necesariamente el origen común. La visión empírica del origen común se basa en la homología de secuencia. La evolución convergente es también una causa probable de homología estructural [36]. A través de la alineación de la estructura y la alineación de la secuencia, encontramos que la gran mayoría de las rodopsinas microbianas y metazoarias comparten un motivo de secuencia WXXY conservado en la sexta hélice. El triptófano y la tirosina en este motivo son aminoácidos cruciales que forman una bolsa de unión a la retina en ambos grupos de rodopsinas [37-41]. La conservación del motivo WXXY en ambos grupos de rodopsina puede explicarse por evolución convergente o por origen común. En este caso, el origen común parece ser más plausible que la evolución convergente. Según la matriz PAM, el triptófano es el aminoácido menos mutable y la tirosina es el quinto aminoácido menos mutable [23].

4.2. La intrincada historia evolutiva de las rodopsinas metazoarias. Solo hay un gen de rodopsina que se encuentra en el gusano de la bellota, mientras que hay 35 genes de rodopsina que se encuentran en el pez cebra. Ningún gen de rodopsina encontrado en esponjas y nematodos indica que la rodopsina no es esencial para la supervivencia de los metazoos. Sin embargo, la capacidad de fotorrecepción otorga a los animales una gran ventaja para su supervivencia. La no esencialidad y la ventaja para la supervivencia hacen que la evolución de las rodopsinas de los metazoos sea un proceso de nacimiento y muerte, en el que el evento de duplicación de genes crea nuevos genes y algunos genes recién creados se mantienen en el genoma mientras que otros desaparecen del genoma acumulando mutaciones deletéreas [42]. Este proceso condujo a varios genes de rodopsina en diferentes especies de metazoos, por ejemplo, el piojo del cuerpo tiene tres genes de rodopsina diferentes, mientras que el mosquito de la malaria tiene nueve, y ambos son insectos. También hizo que la divergencia y subfuncionalización fuera desenfrenada entre los genes de rodopsina duplicados. Hay al menos diez subgrupos diferentes de rodopsinas metazoarias, y sólo un subgrupo funciona directamente como opsinas visuales [11, 1821]. El proceso de nacimiento y muerte produjo una historia evolutiva muy complicada para las rodopsinas metazoarias. Debido a su intrincada historia evolutiva y al gran número de secuencias utilizadas en el análisis filogenético, no pudimos adquirir un árbol filogenético preciso para todas las rodopsinas metazoarias. Entonces, en la inferencia de estados ancestrales, usamos los genes de rodopsina de cada especie para realizar un análisis filogenético con el fin de construir un árbol confiable dentro de cada especie de metazoos.

4.3. Duplicación de genes y transferencia horizontal de genes en rodopsinas microbianas. La duplicación de genes y la transferencia horizontal de genes son comunes en las rodopsinas microbianas. Dos especies microbianas tienen cuatro genes de rodopsina, cinco especies tienen tres genes de rodopsina y once especies tienen dos genes de rodopsina (Tabla complementaria 1). Tanto la duplicación de genes como las transferencias de genes horizontales contribuyen a múltiples copias de rodopsina en estas especies. Por ejemplo, la bacteria Salinibacter ruber M8 tiene cuatro genes de rodopsina. Sus dos rodopsinas sensoriales (Bac_Sal_s1 y Bac_Sal_s2) fueron el resultado de un evento de duplicación de genes, pero están agrupadas con archaea rodopsinas en un árbol microbiano. Significa que Salinibacter ruber M8 obtuvo su rodopsina sensorial original de arqueas a través de la transferencia horizontal de genes. La transferencia horizontal de genes hace imposible rastrear el origen de las rodopsinas microbianas. El hecho de que los tres dominios de la vida tengan rodopsinas microbianas sugiere que la rodopsina microbiana es un gen muy antiguo. Podría ser tan antiguo como la vida misma.

4.4. ¿Son las rodopsinas metazoarias y las rodopsinas microbianas genes homólogos? El objetivo principal de este estudio es responder a la pregunta: ¿son las rodopsinas metazoarias y las rodopsinas microbianas genes homólogos? Debido a la falta de evidencia directa - homología de secuencia, intentamos responder a esta pregunta comparando sus estados ancestrales. La complicada historia evolutiva de las rodopsinas metazoarias hizo difícilmente posible un árbol filogenético general confiable. Eludimos este problema construyendo el árbol filogenético para las rodopsinas metazoarias dentro de cada especie. Luego, utilizando estos árboles confiables, inferimos un estado ancestral para cada especie de metazoos.

En nuestros 24 estados ancestrales de la rodopsina metazoaria, más de la mitad de ellos están relacionados de manera divergente con el estado ancestral de la rodopsina microbiana con significación estadística y menos de la mitad de ellos sin significación estadística (Tabla 2). Hay dos posibles explicaciones de la razón por la cual los otros 11 estados ancestrales de la rodopsina metazoica no muestran significación estadística: (1) el proceso de nacimiento y muerte eliminó algunas rodopsinas metazoarias basales en estas especies. Por lo tanto, sus árboles filogenéticos solo nos permitieron rastrear hasta un estado ancestral reciente en lugar de uno mucho más antiguo (2) en estas especies, las rodopsinas metazoarias existentes divergen de su ancestro tan grandemente que no queda información rastreable en sus secuencias. . Estas dos explicaciones no se excluyen mutuamente.

Para trece estados ancestrales de la rodopsina metazoos relacionados de manera divergente con los estados ancestrales de la rodopsina microbiana con significado estadístico, ¿significa que la rodopsina metazoica y la rodopsina microbiana son genes homólogos? Según la definición de la prueba de Fitch, la respuesta es sí. La región de prueba que seleccionamos tiene un total de 86 aminoácidos. Dentro de la región de prueba, la distancia de mutación promedio entre el metazoo existente y la rodopsina microbiana es de 119 [+ o -] 5 mutaciones en las posiciones del primer y segundo codón. Suponiendo que una mutación en la posición del primer o segundo codón cambiaría su aminoácido codificante, cada codón emparejado en la región de prueba comparte de media aproximadamente 1,38 mutaciones entre dos grupos de rodopsina. Explica por qué no podemos encontrar una homología de secuencia claramente detectable entre las rodopsinas microbianas y metazoarias. Después de la reconstrucción del estado ancestral, la distancia de mutación más corta entre los estados ancestrales microbianos y metazoarios fue de 63 mutaciones. Se encuentra entre el pollo y un estado ancestral microbiano inferido en nueve rodopsinas microbianas, con un valor de p de 0,0045. Hay un total de 86 aminoácidos en la región de prueba. Si las mutaciones se distribuyeran uniformemente en cada codón, habría 63 diferencias de aminoácidos entre los estados ancestrales microbianos y metazoarios. En otras palabras, la identidad de secuencia entre los estados ancestrales microbianos y metazoarios sería de 23 aminoácidos. 23 dividido por 86, es aproximadamente un 26,7% de identidad de secuencia.

En el alineamiento de secuencias por pares, más del 30% de identidad de secuencia es el estándar seguro para proteínas homólogas. Las proteínas que comparten entre el 15% y el 30% de identidad de secuencia se encuentran en la zona de penumbra, lo que significa que su estado homólogo sigue siendo ambiguo [22]. Incluso cuando se remonta en el tiempo mediante la reconstrucción de estados ancestrales, nuestro resultado muestra que solo el 26,7% de identidad de secuencia podría existir en cuatro hélices entre las rodopsinas microbianas ancestrales y metazoarias. Desde el punto de vista convencional, tal resultado todavía no puede probar que los metazoos y las rodopsinas microbianas sean proteínas homólogas. Usando Hydra rodopsin como un grupo externo, solo podemos inferir estados de rodopsina ancestrales metazoarios tan temprano como en ancestros bilaterales. Los registros fósiles muestran que el animal bilateriano más antiguo apareció hace unos 580 millones de años [43]. Sin embargo, basándose en la estimación de genes nucleares, la divergencia temprana de los metazoos se remonta a hace 830 millones de años [44]. No se encuentra ningún gen de rodopsina en la esponja, y la especie microbiana más cercana relacionada con los metazoos en este estudio es el hongo Cryptococcus neoformans var. neoformans. Así que tenemos un tiempo de divergencia de al menos 250 millones de años entre los estados ancestrales microbianos y metazoarios. Tal divergencia de larga data podría explicar la baja identidad de secuencia entre los estados ancestrales microbianos y metazoarios. Ciertamente, la baja identidad de secuencia también podría explicarse aparentemente por la evolución convergente, lo que significa que el gen de la rodopsina apareció de forma independiente en microbios y Metazoos. Pero nuestro resultado muestra que las rodopsinas microbianas ancestrales y las rodopsinas metazoarias ancestrales compartían aproximadamente un 26,7% de identidad de secuencia en cuatro hélices. Es inverosímil creer que las mutaciones aleatorias crearían una estructura casi idéntica al generar largas cadenas de aminoácidos con secuencias similares.

4.5. La posición de la lisina que se une a la retina en la séptima hélice. La alineación de la estructura de las rodopsinas microbianas y metazoarias muestra un fenómeno intrigante: aunque ambos grupos de rodopsinas tienen una lisina de unión a la retina en la séptima hélice, la posición de esta lisina no se conserva estructuralmente entre ellos (Figura 1). Su posición desplaza tres aminoácidos hacia adelante en las rodopsinas metazoarias. Una vez más, la diferente posición de la lisina de unión a la retina podría explicarse simplemente por la evolución convergente. Sin embargo, la mayoría de las rodopsinas microbianas tienen un ácido aspártico en la posición en que las rodopsinas metazoarias tienen una lisina que se une a la retina. En las rodopsinas microbianas, este ácido aspártico funciona como parte del contraión que equilibra la carga positiva de la lisina de unión a la retina [45, 46]. Dado que las pruebas de alineación de la estructura y del estado ancestral sugieren que las rodopsinas microbianas y metazoarias son proteínas homólogas, esto significa que este ácido aspártico cargado negativamente en la rodopsina microbiana mutado a la lisina de unión a la retina cargada positivamente en la rodopsina metazoica. El código genético del ácido aspártico es GAC o GAT, mientras que el código genético de la lisina es AAG o AAA. Estos dos aminoácidos comparten la misma adenina en la posición del segundo codón. La segunda posición del codón tiende a tener la tasa de mutación más lenta entre las tres posiciones del codón [47]. Es probable que Asp (codificación GAC o GAT) primero haya mutado a Asn (codificación AAC o AAT) y luego Asn haya mutado a Lys (codificación AAG o AAA) durante la evolución del gen de la rodopsina.

La lisina de unión a la retina en la séptima hélice es el aminoácido más crucial para la función de fotorrecepción de la rhodospin. Se une al cromóforo retiniano que es responsable de la absorción de luz [1, 2]. Si las rodopsinas microbianas y metazoarias son proteínas homólogas, su lisina de unión a la retina en diferentes posiciones significa que la función de fotorrecepción se perdió una vez durante la evolución del gen de la rodopsina. En la rodopsina metazoica, la mutación de rescate de esta lisina rescató la función de fotorrecepción en la rodopsina metazoaria. La lisina una vez perdida explica por qué no existe una homología de secuencia claramente detectable entre las rodopsinas microbianas y metazoarias. Durante la evolución de organismos unicelulares a animales multicelulares, el gen de la rodopsina en el antepasado metazoario temprano perdió la lisina de unión a la retina y, por lo tanto, perdió su función de fotorrecepción. La pérdida de función liberó al gen de la rodopsina de la restricción funcional, y el proceso de divergencia cambió rápidamente su secuencia original más allá del reconocimiento. Inexplicablemente, en la evolución posterior de los metazoos, uno de esos genes de rodopsina con pérdida de función logró recuperar una lisina en su séptima hélice a través de una mutación aleatoria y, por lo tanto, rescató su función de fotorrecepción.

Con base en nuestro análisis, proponemos que las rodopsinas microbianas y metazoarias son proteínas homólogas y la función de fotorrecepción se perdió una vez durante la evolución del gen de la rodopsina. Esta conclusión puede ser controvertida según la visión convencional de las proteínas homólogas. Lógicamente, la opinión de que las rodopsinas microbianas y metazoarias son proteínas homólogas es la más parsimoniosa. No requiere otra proteína para ser precursora de las rodopsinas metazoarias. La naturaleza acaba de reciclar la proteína de siete hélices transmembrana para la fotorrecepción. Sin embargo, la visión alternativa de que la estructura casi idéntica entre las rodopsinas microbianas y metazoarias es el resultado de la evolución convergente requiere mutaciones aleatorias para crear dos dominios de siete hélices transmembrana mediante la generación de cadenas largas de aminoácidos con secuencias similares. El dominio de siete hélices transmembrana realiza otras funciones además de la fotorrecepción en Metazoa [48]. Forman una gran familia de proteínas de receptores acoplados a proteína G que incluyen la rodopsina metazoaria y el receptor olfativo. La investigación muestra que la mayoría de estos receptores de siete transmembranas comparten un origen común [49]. Es natural que alguien se pregunte cuál fue el origen de todos estos receptores de siete transmembranas. No existe ningún receptor antiguo de siete transmembranas aparte de las rodopsinas microbianas que podrían ser tan antiguas como la vida misma. Para aquellos que creen que la estructura idéntica entre las rodopsinas microbianas y metazoarias es el resultado de la evolución convergente, tendrán que responder a estas dos preguntas: (1) ¿cuál fue el precursor de todos los receptores de siete transmembrana en los metazoos? (2) si tal precursor existió, ¿cómo podrían las mutaciones aleatorias darle forma en siete hélices transmembrana mediante la generación de largas cadenas de aminoácidos que también son similares a un subconjunto de rodopsinas microbianas? Por otro lado, nuestra inferencia de estado ancestral no pudo proporcionar una secuencia de identidad decisiva entre las rodopsinas ancestrales microbianas y metazoarias. La identidad de secuencia ambigua podría explicarse por la restricción funcional una vez aliviada y el largo tiempo de divergencia entre microbios y metazoos. La brecha de tiempo de divergencia podría llenarse mediante el uso de genes relacionados con la rodopsina de animales basales para la inferencia de estados ancestrales. Los futuros proyectos de genoma para animales basales podrían tener la respuesta definitiva a la cuestión de la relación evolutiva entre la rodopsina microbiana y la rodopsina metazoica.

Los autores agradecen al Dr. Xun Gu (Universidad de Fudan y Universidad Estatal de Iowa) por sus sugerencias de investigación en esta investigación. Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Programa Nacional de Investigación Básica (2012CB944600), el Ministerio de Ciencia y Tecnología (2011BAI09B00) y la Fundación Nacional de Ciencias de China (30890034).

[1] K. Nakanishi, "11-cis-retinal, una molécula especialmente adecuada para la visión", Pure and Applied Chemistry, vol. 63, págs. 161-170, 1991.

[2] J. L. Spudich, C. S. Yang, K. H. Jung y E. N. Spudich, "Proteínas de retinilideno: estructuras y funciones desde las arqueas hasta los humanos", Revisión anual de biología celular y del desarrollo, vol. 16, págs. 365-392, 2000.

[3] B. Schobert y J. K. Lanyi, "Halorhodopsin es una bomba de cloruro impulsada por la luz", Journal of Biological Chemistry, vol. 257, no. 17, págs. 10306-10313, 1982.

[4] O. Beja, L. Aravind, E. V. Koonin et al., "Rodopsina bacteriana: evidencia de un nuevo tipo de fototrofia en el mar", Science, vol. 289, no. 5486, págs. 1902-1906, 2000.

[5] O. A. Sineshchekov, K. H. Jung y J. L. Spudich, "Dos rodopsinas median la fototaxis a la luz de baja y alta intensidad en Chlamydomonas reinhardtii", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 99, no. 13, págs. 8689-8694, 2002.

[6] K. H. Jung, V. D. Trivedi y J. L. Spudich, "Demostración de una rodopsina sensorial en eubacterias", Microbiología molecular, vol. 47, no. 6, págs. 1513-1522, 2003.

[7] A. Terakita, "Las opsinas", Genome Biology, vol. 6, no. 3, artículo 213, 2005.

[8] S. A. Waschuk, A. G. Bezerra, L. Shi y L. S. Brown, "Leptosphaeria rhodopsin: bomba de protones similar a la bacteriorrodopsina de un eucariota", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 102, no. 19, págs. 68796883, 2005.

[9] D. Arendt, K. Tessmar-Raible, H. Snyman, A. W. Dorresteijn y J. Wittbrodf, "Fotorreceptores ciliares con una opsina de tipo vertebrado en un cerebro invertebrado", Science, vol. 306, no. 5697, págs. 869-871, 2004.

[10] M. Koyanagi, K. Kubokawa, H. Tsukamoto, Y. Shichida y A. Terakita, "Melanopsina cefalocordada: vínculo evolutivo entre células visuales de invertebrados y células ganglionares de retina fotosensibles de vertebrados", Current Biology, vol. 15, no. 11, págs. 10651069, 2005.

[11] M. Koyanagi y A. Terakita, "subfamilia de rodopsina acoplada a Gq compuesta de pigmento visual de invertebrados y melanopsina", Photochemistry and Photobiology. Vol. 84, no. 4, págs. 1024-1030, 2008.

[12] I. Provencio, G. Jiang, WJ De Grip, W. Par Hayes y MD Rollag, "Melanopsin: an opsin in melanophores, brain, and eye", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 95, no. 1, págs. 340-345, 1998.

[13] E. E. Tarttelin, J. Bellingham, M. W. Hankins, R. G. Foster y R. J. Lucas, "Neuropsina (Opn5): una nueva opsina identificada en tejido neural de mamíferos", FEBS Letters, vol. 554, no. 3, págs.410416, 2003.

[14] S. Blackshaw y S. H. Snyder, "Encefalopsina: una nueva opsina extrarretiniana de mamíferos discretamente localizada en el cerebro", Journal of Neuroscience, vol. 19, no. 10, págs. 3681-3690, 1999.

[15] M. Jiang, S. Pandey y H. K. W. Fong, "Un homólogo de opsina en la retina y el epitelio pigmentario", Oftalmología de investigación y ciencia visual, vol. 34, no. 13, págs. 3669-3678, 1993.

[16] D. Shen, M. Jiang, W. Hao, L. Tao, M. Salazar y H. K. W. Fong, "Un gen relacionado con la opsina humana que codifica una proteína de unión a retinaldehído", Biochemistry, vol. 33, no. 44, págs. 13117-13125, 1994.

[17] H. Sun, DJ Gilbert, NG Copeland, NA Jenkins y J. Nathans, "Peropsina, una nueva proteína similar a un pigmento visual ubicada en las microvellosidades apicales del epitelio pigmentario de la retina", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 94, no. 18, págs. 9893-9898, 1997.

[18] M. Max, P. J. McKinnon, K. J. Seidenman y col., "Opsina pineal: una opsina no visual expresada en la glándula pineal", Science, vol. 267, no. 5203, págs. 1502-1506, 1995.

[19] S. Blackshaw y S. H. Snyder, "La parapinopsina, una nueva opsina de bagre localizada en el órgano parapineal, define una nueva familia de genes", Journal of Neuroscience, vol. 17, no. 21, págs. 8083-8092, 1997.

[20] AR Philp, JM García-Fernández, BG Soni, RJ Lucas, J. Bellingham y RG Foster, "Opsina antigua de vertebrados (VA) y fotorrecepción extrarretiniana en el salmón del Atlántico (Salmo salar)", Journal of Experimental Biology, vol. 203, no. 12, págs. 1925-1936, 2000.

[21] P. Moutsaki, D. Whitmore, J. Bellingham, K. Sakamoto, Z. K. David-Gray y R. G. Foster, "Opsina de tejido múltiple teleósteo (tmt): ¿un fotopigmento candidato que regula los relojes periféricos del pez cebra?" Investigación del cerebro molecular, vol. 112, no. 1-2, págs. 135-145, 2003.

[22] W. R. Pearson, "Comparación de secuencias de proteínas y evolución de proteínas", Tutorial, ISMB2000, 2001.

[23] M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz y B. C. Orcutt, "Un modelo de cambio evolutivo en proteínas", Atlas de secuencia y estructura de proteínas, vol. 5, no. 3, págs. 345-352, 1978.

[24] W. M. Fitch, "Distinguir proteínas homólogas de análogas", Zoología sistemática, vol. 19, no. 2, págs. 99-113, 1970.

[25] D. Lawson, P. Arensburger, P. Atkinson y col., "VectorBase: un recurso de datos para la genómica de vectores de invertebrados", Nucleic Acids Research, vol. 37, no. 1, págs. D583-D587, 2009.

[26] S. F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers y D. J.Lipman, "Herramienta básica de búsqueda de alineación local", Journal of Molecular Biology, vol. 215, no. 3, págs. 403-410, 1990.

[27] W. R. Pearson y D. J. Lipman, "Herramientas mejoradas para la comparación de secuencias biológicas", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 85, no. 8, págs. 24442448, 1988.

[28] R. C. Edgar, "MÚSCULO: alineación de secuencia múltiple con alta precisión y alto rendimiento", Nucleic Acids Research, vol. 32, no. 5, págs. 1792-1797, 2004.

[29] C. Guda, S. Lu, E. D. Scheeff, P. E. Bourne e I. N. Shindyalov, "CE-MC: un servidor de alineación de estructuras de proteínas múltiples", Nucleic Acids Research, vol. 32, págs. W100-W103, 2004.

[30] F. Abascal, R. Zardoya y D. Posada, "ProtTest: selección de los mejores modelos de evolución de proteínas", Bioinformática, vol. 21, no. 9, págs. 2104-2105, 2005.

[31] K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei y S. Kumar, "MEGA5: análisis de genética evolutiva molecular utilizando métodos de máxima verosimilitud, distancia evolutiva y máxima parsimonia", Biología Molecular y Evolution, vol. 28, no. 10, págs. 2731-2739, 2011.

[32] S. Guindon, JF Dufayard, V Lefort, M. Anisimova, W. Hordijk y O. Gascuel, "Nuevos algoritmos y métodos para estimar filogenias de máxima verosimilitud: evaluación del rendimiento de PhyML 3.0", Biología Sistemática, vol. . 59, no. 3, págs.307-321, 2010.

[33] M. Anisimova y O. Gascuel, "Prueba de razón de verosimilitud aproximada para ramas: una alternativa rápida, precisa y poderosa", Biología Sistemática, vol. 55, no. 4, págs. 539-552, 2006.

[34] J. P. Huelsenbeck y F. Ronquist, "MRBAYES: inferencia bayesiana de árboles filogenéticos", Bioinformática, vol. 17, no. 8, págs. 754-755, 2001.

[35] J. Felsenstein, "Phylogeny Inference Package (PHYLIP)", versión 3.5., Universidad de Washington, Seattle, Wash, EE.UU., 1993.

[36] R. F. Doolittle, "Evolución convergente: la necesidad de ser explícito", Trends in Biochemical Sciences, vol. 19, no. 1, págs. 15-18, 1994.

[37] H. Luecke, B. Schobert, H. T. Richter, J. P. Cartailler y J. K. Lanyi, "Estructura de la bacteriorrodopsina en 1,55 una resolución", Journal of Molecular Biology, vol. 291, no. 4, págs. 899-911, 1999.

[38] K. Edman, A. Royant, P. Nollert et al., "Reordenamientos estructurales tempranos en el fotociclo de un receptor sensorial de membrana integral", Estructura, vol. 10, no. 4, págs. 473-482, 2002.

[39] T. Okada, M. Sugihara, AN Bondar, M. Elstner, P. Entel y V Buss, "La conformación retiniana y su entorno en la rodopsina a la luz de una nueva estructura cristalina 2.2 A", Journal of Molecular Biology , vol. 342, no. 2, págs. 571-583, 2004.

[40] L. Vogeley, O. A. Sineshchekov, V D. Trivedi, J. Sasaki, J. L. Spudich y H. Luecke, "Rodopsina sensorial Anabaena: un sensor de color fotocrómico a 2,0 A", Science, vol. 306, no. 5700, págs. 1390-1393, 2004.

[41] M. Murakami y T. Kouyama, "Estructura cristalina de la rodopsina de calamar", Nature, vol. 453, no. 7193, págs. 363-367, 2008.

[42] M. Nei, X. Gu y T. Sitnikova, "Evolución por el proceso de nacimiento y muerte en familias multigénicas del sistema inmunológico de vertebrados", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 94, págs.7799-7806, 1997

[43] A. H. Knoll y S. B. Carroll, "Evolución animal temprana: puntos de vista emergentes de la biología y la geología comparadas", Science, vol. 284, no. 5423, págs. 2129-2137, 1999.

[44] X. Gu, "La divergencia temprana de los metazoos fue hace unos 830 millones de años", Journal of Molecular Evolution, vol. 47, no. 3, págs. 369-371, 1998.

[45] T Marti, S. J. Rosselet, H. Otto, M. P. Heyn y H. G. Khorana, "El contraión de base de retinilideno de Schiff en la bacteriorrodopsina", Journal of Biological Chemistry, vol. 266, no. 28, págs. 1867418683, 1991.

[46] H. Luecke, B. Schobert, J. Stagno et al., "Estructura cristalográfica de xanthorhodopsin, la bomba de protones impulsada por luz con un cromóforo dual", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 105, no. 43, págs.16561-16565, 2008.

[47] L. Bofkin y N. Goldman, "Variación en los procesos evolutivos en diferentes posiciones de codones", Biología Molecular y Evolución, vol. 24, no. 2, págs. 513-521, 2007

[48] ​​V Katritch, V Cherezov y R. C. Stevens, "Diversidad y modularidad de las estructuras del receptor acoplado a proteína G", Trends in Pharmacological Sciences, vol. 33, no. 1, págs. 17-27, 2012.

[49] KJ Nordstrom, M. Sallman Almen, MM Edstam, R. Fredriksson y HB Schioth, "Independent HHsearch, Needleman-Wunsch-based, y análisis de motivos revelan la jerarquía general para la mayoría de las familias de receptores acoplados a proteína G, "Biología Molecular y Evolución, vol. 28, no. 9, págs. 2471-2480, 2011.

Libing Shen, Chao Chen, Hongxiang Zheng y Li Jin

Laboratorio Estatal Clave de Ingeniería Genética y Laboratorio Clave de Antropología Contemporánea del Ministerio de Educación, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Fudan, Shanghai 200433, China


La relación evolutiva entre las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias

Las rodopsinas son proteínas fotorreceptoras con siete hélices alfa transmembrana y una retina unida covalentemente. Según sus secuencias de proteínas, las rodopsinas se pueden clasificar en rodopsinas microbianas y rodopsinas metazoarias. Debido a que no existe una identidad de secuencia claramente detectable entre estos dos grupos, su relación evolutiva fue difícil de decidir. A través de la inferencia de estados ancestrales, encontramos que las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias están relacionadas de manera divergente en sus dominios de siete transmembrana. Nuestro resultado propone que son proteínas homólogas y rodopsinas metazoarias originadas a partir de rodopsinas microbianas. La alineación de la estructura muestra que las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias comparten una homología estructural notable, mientras que la posición de la lisina de unión a la retina es diferente entre ellas. Sugiere que la función de la fotorrecepción se perdió una vez durante la evolución de los genes de la rodopsina. Este resultado explica por qué no hay una similitud de secuencia claramente detectable entre los dos grupos de rodopsina: después de perder la función de fotorrecepción, el gen de la rodopsina se liberó de la restricción funcional y el proceso de divergencia podría cambiar rápidamente su secuencia original más allá del reconocimiento.

1. Introducción

La rodopsina es una clase de proteínas cuyas características comunes son una apoproteína de hélice alfa de siete transmembranas y un cofactor de la retina [1, 2]. La retina funciona como un cromóforo de rodopsina que es responsable de la absorción de luz. Se une de forma reversible y covalente a una lisina en la séptima hélice de la apoproteína. Por así decirlo, la parte proteica de la rodopsina es su base estructural, mientras que la retina es la columna vertebral funcional de la rodopsina. Las rodopsinas se encuentran de forma ubicua en tres dominios de la vida: arqueas, eubacterias y eucariotas [3-7]. Según sus secuencias de proteínas, las rodopsinas se pueden clasificar en dos grupos: rodopsinas de tipo 1 y rodopsinas de tipo 2 [2]. Las rodopsinas de tipo 1 existen en organismos unicelulares, mientras que las rodopsinas de tipo 2 solo aparecen en animales multicelulares. Por conveniencia, llamamos rodopsinas microbianas tipo 1 rodopsinas y rodopsinas tipo 2 metazoos rodopsinas en este estudio. Las rodopsinas microbianas funcionan como receptores de fototaxis (rodopsina sensorial), transportadores de iones de cloruro o protones impulsados ​​por la luz (bacteriorrodopsina y halorhodopsina) [2, 3, 5, 6, 8]. Las rodopsinas metazoarias funcionan principalmente como receptores visuales en los ojos de los animales, como las opsinas de varilla o cono [9-11]. Al igual que las rodopsinas microbianas, las rodopsinas metazoarias también realizan funciones no sensoriales. La melanopsina, expresada en el cerebro y los ojos, puede estar implicada en los ritmos circadianos y el reflejo papilar [12]. La neuropsina (Opn5) se expresa predominantemente en tejidos neurales [13]. La encefalopsina se expresa en el cerebro y los órganos viscerales [14]. La opsina RGR, expresada en el epitelio pigmentario de la retina (RPE) y las células de Müller, funciona como la fotoisomerasa [15, 16]. La peropsina se expresa en las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) [17]. Hasta ahora, los investigadores han identificado nueve subgrupos de opsinas no visuales en Metazoa [18-21].

La relación evolutiva entre las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias es difícil de decidir, porque no muestran una identidad claramente detectable a nivel de secuencia. Aunque la falta de identidad de secuencia no puede utilizarse para demostrar que no son proteínas homólogas, la identidad de secuencia es la piedra angular del conocimiento convencional de la homología de proteínas [22]. Debido a la divergencia evolutiva, la identidad de secuencia en diferentes proteínas homólogas disminuye con el tiempo. Nuestra capacidad para detectar homología de secuencia en proteínas relacionadas depende de su tasa de divergencia y distancia evolutiva [23]. Usando la matriz PAM, Dayhoff et al. muestran que la limitación de la identidad de secuencia para deducir la homología de proteínas es de alrededor del 20% de identidad [23]. Si dos proteínas comparten menos del 20% de identidad de secuencia, significa que no son proteínas homólogas o que su origen común se borra en la evolución.

Hay dos escenarios evolutivos posibles para las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias: (1) usar retinal como cromóforo, unir retinal con una lisina y un dominio similar de siete transmembranas son el resultado de la evolución convergente (2) sus características comunes son el legado de un común ancestro, sin embargo, su identidad de secuencia es apenas detectable debido a la divergencia rápida y / o prolongada.

Para investigar la relación evolutiva entre las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias, tenemos que evitar el problema de la falta de similitud de secuencia. Fitch desarrolló un método estadístico para distinguir las proteínas homólogas de las no homólogas [24]. Su método compara el estado ancestral de un grupo de proteínas con el estado ancestral de otro. Evita la necesidad de identidad de secuencia para decidir la relación evolutiva entre dos grupos de proteínas. En este estudio, usamos su método para probar si las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias son proteínas homólogas o no.

2. Materiales y métodos

2.1. Datos de estructura

Una búsqueda directa en la base de datos de PDB arrojó dos rodospinas de metazoos y cinco rodopsinas microbianas con datos de estructura (Tabla 1).

2.2. Datos de secuencia

Las secuencias de proteínas del genoma completo y las secuencias de ADNc correspondientes para veintisiete especies de metazoos se descargaron de la base de datos Ensembl, la base de datos NCBI y VectorBase [25]. Estas especies cubren siete filos: Porifera, Cnidaria, Nematoda, Arthropoda, Chordata, Hemichordata y Echinodermata. La especie en Chordata también representó clases importantes en este filo. Usamos un script en Perl para extraer las transcripciones más largas de cada genoma en este estudio.

2.3. BLAST y FASTA buscan genes de rodopsina en los datos del genoma

Utilizamos BLAST para buscar genes de rodopsina en genomas microbianos [26]. Utilizando cinco rodopsinas microbianas con datos de estructura como consultas, buscamos en la base de datos completa del genoma microbiano, la base de datos del genoma de los hongos y la base de datos del genoma de las algas verdes en el sitio web del NCBI. Los parámetros de BLAST se establecieron de la siguiente manera: las secuencias objetivo máximas fueron 500, el umbral esperado fue 0,001 y los demás fueron predeterminados.

Utilizamos FASTA 3.5 para buscar genes de rodopsina en cada genoma de metazoos [27]. Dos rodopsinas metazoarias con datos de estructura sirvieron como consultas. El valor E para la búsqueda FASTA se estableció en 0,001.

Los resultados de búsqueda en BLAST o FASTA se alinearon con las secuencias de consulta utilizando MUSCLE con los parámetros predeterminados [28]. Los aciertos se identificaron como candidatos a rodopsinas solo cuando comparten una lisina conservada de unión a la retina en la séptima hélice en la misma posición que las consultas. Eliminamos los resultados candidatos redundantes y cualquier secuencia de menos de 200 aminoácidos o de más de 1000 aminoácidos.

2.4. Alineación de estructura

Utilizando sus archivos PBD, dos estructuras de proteínas de metazoos rhodospin y cinco estructuras de proteínas microbianas de rodopsina se alinearon con el servidor de alineación de estructuras de proteínas múltiples CE-MC con parámetros predeterminados [29].

2.5. Alineación de secuencia

Las secuencias de proteínas de rodopsina microbianas o metazoarias se alinearon utilizando MUSCLE con los parámetros predeterminados [28]. Todas las secuencias de nucleótidos en este estudio se alinearon de acuerdo con su resultado de alineación de secuencias de proteínas.

2.6. Selección de la región de prueba

Aunque no existe una identidad de secuencia claramente detectable, la estructura de la proteína es algo comparable entre las rodopsinas microbianas y metazoarias. La selección de la región de prueba entre las rodopsinas microbianas y metazoarias se basó en la alineación de su estructura. El problema que encontramos aquí es que los datos de estructura son mucho más escasos que los datos de secuencia en ambos grupos de rodopsinas. Solo dos rodospinas de metazoos y cinco rodopsinas microbianas tienen datos de estructura. Entonces, tenemos que usar su alineación de estructura como una guía para inferir el dominio de siete transmembranas en su alineación de secuencia.

Todas las rodopsinas microbianas comparten una homología de secuencia claramente detectable, así como todas las rodopsinas metazoarias, por lo que el resultado de la alineación de secuencias es confiable dentro del grupo microbiano o metazoario. Sin embargo, el resultado de la alineación de la estructura no siempre coincide con el resultado de la alineación de la secuencia, es decir, la homología posicional propuesta por la alineación de la estructura microbiana puede no ser la misma propuesta por la alineación de la secuencia microbiana. Nuestra solución es que primero alineamos todas las secuencias de rhodospin microbianas usando MUSCLE. Luego, seleccionamos cinco secuencias de rodopsina microbiana con datos de estructura en el resultado de la alineación MUSCLE y comparamos su alineación de secuencia con su alineación de estructura. Al hacerlo, pudimos identificar la homología posicional acordada por ambos métodos de alineación. Repetimos esta práctica en las rodopsinas metazoarias utilizando la alineación de la estructura de calamares y rodopsinas bovinas como guía. La región de prueba final es el resultado de la alineación acordado por las alineaciones de estructura y secuencia.

2.7. Análisis filogenético e inferencia del estado ancestral

Se utilizaron métodos de unión de vecinos, bayesianos y de máxima verosimilitud para construir un árbol filogenético de rodopsinas microbianas o metazoarias. ProtTest se utilizó para seleccionar modelos de evolución para nuestros análisis filogenéticos [30]. MEGA 5 se utilizó para construir el árbol NJ con la opción de "eliminación por pares" y el modelo "JTT" [31]. Las velocidades y los patrones se establecieron como "Gamma distribuido", y el parámetro Gamma se estableció como "4". Se utilizó el método Bootstrap para probar la filogenia, y el número de réplicas de bootstrap se estableció como “500”. Se utilizó PhyML 3.0 para construir el árbol ML con el modelo "WAG" [32]. La proporción de sitios invariables y el parámetro de forma gamma se estimaron a partir del resultado de la alineación. Se utilizó una prueba de razón de verosimilitud aproximada para probar la confiabilidad de la rama [33]. MrBayes 3.1.1 se utilizó para construir un árbol bayesiano con el modelo "WAG" [34]. Corrimos durante 500.000 generaciones y muestreamos árboles de probabilidad posterior cada 1000 generaciones. Resumimos el 25% de los valores de los parámetros y de los árboles para obtener el árbol de consenso.

El paquete PHYLIP se utilizó para construir el árbol Fitch-Margoliash de genes de rodopsina dentro de cada especie de metazoos [35]. El árbol de rodopsina dentro de la especie se construyó con el modelo "JTT" y se probó con 100 réplicas de arranque.

Los árboles filogenéticos sirvieron como historia evolutiva para nuestra inferencia de estado ancestral. El método de la parsimonia se utilizó para inferir estados ancestrales [24]. Escribimos un script en Perl para implementar este método.

2.8. Prueba de parentesco en estados ancestrales

La prueba de parentesco en dos estados ancestrales es un método estadístico que Fitch ideó en su artículo de 1970 [24]. La idea básica detrás de esta prueba es que la probabilidad de parentesco se puede calcular comparando la distancia de mutación observada entre dos estados ancestrales con la distancia de mutación esperada entre ellos. La distancia de mutación observada son las diferencias de nucleótidos reales entre dos estados ancestrales. La distancia de mutación esperada entre dos estados ancestrales es la probabilidad de conjuntos de nucleótidos disjuntos elegidos al azar entre ellos multiplicada por la longitud de su secuencia. La desviación estándar entre dos distancias es la raíz cuadrada de la distancia esperada multiplicada por la probabilidad de conjuntos de nucleótidos intersectantes elegidos al azar entre ellos. El número de desviaciones estándar entre la distancia de mutación observada y la distancia de mutación esperada sigue la distribución normal. La probabilidad de su valor se puede encontrar en la tabla de probabilidad normal y se usa como probabilidad de significancia.

3. Resultados

3.1. Homología estructural entre la rodopsina microbiana y la rodopsina metazoica

La alineación de la estructura de cinco rodopsinas microbianas y dos rhodospins metazoos muestra que todas las rodopsinas comparten una homología estructural notable (Figura 1). Se conservan siete hélices transmembrana dentro de las rodopsinas microbianas o metazoarias y entre ellas. Aunque no existe una homología de secuencia claramente detectable entre estos dos grupos de rodopsinas, la alineación de la estructura revela que comparten un motivo de secuencia WXXY conservado en la sexta hélice. Curiosamente, la lisina que se une a la retina en el séptimo no se conserva estructuralmente y se ubica en una posición diferente entre ellas. También hay una inserción / deleción / a en la séptima hélice entre estos dos grupos de rodopsinas, que es solo un aminoácido antes de la lisina crucial en las rodopsinas microbianas (inserción) o un aminoácido después de la lisina crucial en las rodopsinas metazoarias (deleción). . Entonces, la posición de la lisina de unión a la retina desplaza tres aminoácidos hacia adelante en las rodopsinas metazoarias.


Alineación de la estructura de la rodopsina de calamar (2Z73: A | PDB, rodopsina metazoica), rodopsina bovina (1U19: A | PDB, rodopsina metazoica), Anabaena rodopsina sensorial (1XIO: A | PDB, rodopsina microbiana), Natronomonas rodopsina II sensorial (1GU8: A | PDB, rodopsina microbiana), Halobacterium salinarum bacteriorrodopsina (1JV6: A | PDB, rodopsina microbiana), Natronomonas halorhodopsin (3A7 K: A | PDB, rodopsina microbiana), y Salinibacter ruber xantorrodopsina (3DDL: A | PDB, rodopsina microbiana). La rodopsina de calamar se utiliza como plantilla para delinear siete hélices transmembrana. Los residuos sombreados son homólogos estructurales. El triptófano y la tirosina conservados en el motivo WXXY están marcados con asteriscos negros. La lisina que se une a la retina tiene un estilo atrevido y está empaquetada. El ácido aspártico en la rodopsina microbiana correspondiente a la lisina de unión a la retina en la rodopsina metazoica está en negrita y subrayado. La región de prueba está marcada con líneas finas.
3.2. Genes de rodopsina en genomas microbianos y metazoarios

La búsqueda BLAST de rodopsinas microbianas regresó con 62 rodopsinas microbianas (consulte la Tabla S1 en el Material complementario disponible en línea en http://dx.doi.org/10.1155/2013/435651). La búsqueda de FASTA de rodopsinas metazoarias regresó con 227 rodopsinas metazoarias de 25 especies (Tabla 2).

En 62 rodopsinas microbianas, treinta y cinco de ellas son de bacterias, veinticuatro son de arqueas y tres son de eucariotas. Bacteria Salinibacter ruber M8 y arqueas Haloarcula marismortui ATCC 43049 tienen cuatro copias diferentes del gen de la rodopsina. Una especie de bacteria y cuatro especies de arqueas tienen tres genes de rodopsina diferentes. Once especies microbianas tienen dos genes de rodopsina diferentes. Entre tres rodopsinas microbianas eucariotas, dos de ellas son de alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii y uno es de levadura encapsulada Cryptococcus neoformans var. neoformans.

La Tabla 2 muestra el número de genes de rodopsina en cada especie de metazoos. Nombramos genes de rhodospin en orden numérico dentro de cada especie de metazoos. El número de genes de rodopsina varía drásticamente en cada especie de metazoos. En los insectos, el mosquito de la malaria tiene nueve genes de rodopsina, mientras que la blusa corporal solo tiene tres. No se encuentra ningún gen de rodopsina en la esponja Amphimedon queenslandica y nematodo Caenorhabditis elegans, aunque tienen genes relacionados con la rodopsina.

3.3. Región de prueba final

La región de prueba final que seleccionamos es el resultado de alineación consistente entre las alineaciones de estructura y secuencia. No se encuentra una región consistente en las hélices A, B o D. En la hélice C, hay una región consistente de 18 aminoácidos. En la hélice E, hay dos regiones consistentes: una tiene una longitud de 11 aminoácidos y la otra tiene una longitud de 14 aminoácidos. En la hélice F, hay una región consistente de 25 aminoácidos. En la hélice G, hay una región consistente de 18 aminoácidos. La región de prueba total tiene una longitud de 86 aminoácidos y es igual a 258 nucleótidos.

3.4. La historia evolutiva y la inferencia del estado ancestral en las rodopsinas metazoarias

Usamos tres métodos diferentes para construir árboles filogenéticos para todas las rodopsinas metazoarias en este estudio. Hidra Las rodopsinas sirven como un grupo externo para enraizar árboles metazoarios. En nuestro estudio, Hidra es el único animal de Cnidaria. Es el filo basal de Arthropoda, Chordata, Hemichordata y Echinodermata. Arraigado con Hidra rodopsinas, tres árboles muestran tres topologías generales diferentes. El árbol de unión de vecinos muestra todos los genes de rodopsina divididos en tres clados principales excepto Hidra rodopsinas (Figura complementaria 1). Un clado consta principalmente de rodopsinas cordados y no rodopsinas artrópodas. Los otros dos clados contienen rodopsinas cordados y artrópodos. El árbol de máxima verosimilitud muestra una historia evolutiva diferente del árbol de NJ (Figura complementaria 2). El árbol ML tiene cuatro clados principales en lugar de tres. El árbol bayesiano muestra una historia evolutiva más complicada (Figura complementaria 3). Tres clados separados en el árbol de Nueva Jersey se mezclan en el árbol bayesiano. No sabíamos qué árbol es el más confiable de los tres árboles. Tres árboles produjeron tres estados ancestrales diferentes. Solo un estado es cierto, porque todas las rodopsinas metazoarias comparten solo una historia evolutiva.

Con el fin de obtener un estado ancestral confiable, construimos el árbol filogenético para las rodopsinas dentro de cada especie de metazoos en lugar de para todas las rodopsinas de los metazoos (Figuras 2 (a) y 2 (b)). Al reducir el número de taxones en la construcción de árboles, podríamos obtener árboles más confiables para la inferencia de estados ancestrales. Sin embargo, al hacerlo, tuvimos que inferir un estado ancestral para cada especie de metazoos. Usando uno Hidra rodopsina como un grupo externo, construimos 24 árboles de rodopsina metazoos e inferimos 24 estados ancestrales basados ​​en estos árboles. Dieciocho de ellos son posibles estados ancestrales de la rodopsina metazoaria en Chordata. Cuatro de ellos son posibles estados ancestrales en Arthropoda. Dos de ellos son posibles estados ancestrales en Hemichordata y Echinodermata.


(a)
(B)
(a)
(B) (a) Árbol de Fitch-Margoliash para todos los genes de rodopsina en humanos. (b) Árbol de Fitch-Margoliash para todos los genes de rodopsina en pollo. Hidra El gen de la rodopsina actúa como grupo externo. Los números adyacentes a los nodos del árbol son valores de arranque. El nodo del árbol donde se construye el estado ancestral está marcado con un cuadrado negro relleno
3.5. La historia evolutiva y la inferencia del estado ancestral en las rodopsinas microbianas

También utilizamos tres métodos diferentes para construir árboles filogenéticos para todas las rodopsinas microbianas. Tres árboles microbianos son consistentes en topologías generales, aunque difieren en la posición de una rama que contiene seis bacterias rodopsinas (Figuras complementarias 4, 5 y 6). El problema es que las bacterias y las arqueas son clados hermanos en la sistemática biológica. Significa que no podemos enraizar árboles microbianos. Si no pudiéramos decidir un grupo externo para los árboles microbianos, no seríamos capaces de inferir ningún estado ancestral con ellos.

Para superar este problema, primero intentamos encontrar qué subárbol microbiano es el árbol candidato más posible para la inferencia de estados ancestrales. Utilizando el método de Fitch, probamos cada gen de la rhodospin microbiano existente con 24 estados ancestrales de metazoos. Encontramos que tres rodopsinas microbianas están relacionadas lejanamente con estados ancestrales metazoarios con significación estadística (Tabla complementaria 2). Estas tres rodopsinas están ubicadas en un solo subárbol que contiene 13 rodopsinas microbianas (Figura 3). Luego inferimos todos los posibles estados ancestrales de la rodopsina microbiana en este subárbol.


Árbol bayesiano sin raíces para todos los genes de rodopsina microbiana. Los números adyacentes a los nodos son valores de probabilidad posteriores. La longitud de la rama refleja la divergencia evolutiva. Los genes de la rodopsina microbiana relacionados lejanamente con los estados ancestrales de la rodopsina metazoaria (& gt95% cuantil) están marcados con un triángulo negro relleno ▲. El nodo del árbol donde se construye el estado ancestral de la rodopsina microbiana está marcado con un cuadrado negro relleno
3.6. La relación entre los estados ancestrales de las rodopsinas microbianas y los estados ancestrales de las rodopsinas metazoarias

Probamos 24 estados ancestrales de la rodopsina metazoaria con todos los estados ancestrales posibles de la rodopsina microbiana en el subárbol candidato. Entre todos los estados ancestrales de la rodopsina microbiana inferidos, un estado ancestral de la rodopsina microbiana tiene la menor distancia de mutación con los estados ancestrales de la rodopsina metazoaria (Figura 3). Este estado ancestral microbiano se reconstruye sobre un hongo rodopsina, una bacteria rodopsina y ocho arqueas rodopsinas. El resultado de la prueba muestra que los estados ancestrales de la rodopsina de 13 metazoos están relacionados de manera divergente con ella con significación estadística (Tabla 3). Estos estados ancestrales cubren Arthropoda, Chordata, Hemichordata, Echinodermata y dos subphyla en Chordata: Tunicata (ascidia) y Cephalochordata (amphioxus).

mutaciones en las posiciones del primer y segundo codón.

4. Discusión

4.1. Homología estructural versus origen común

Las rodopsinas microbianas y las rodopsinas metazoarias comparten una homología estructural notable en sus siete hélices (Figura 1). Sin embargo, la homología estructural no indica necesariamente el origen común. La visión empírica del origen común se basa en la homología de secuencia. La evolución convergente es también una causa probable de homología estructural [36]. A través de la alineación de la estructura y la alineación de la secuencia, encontramos que la gran mayoría de las rodopsinas microbianas y metazoarias comparten un motivo de secuencia WXXY conservado en la sexta hélice. El triptófano y la tirosina en este motivo son aminoácidos cruciales que forman una bolsa de unión a la retina en ambos grupos de rodopsinas [37-41]. La conservación del motivo WXXY en ambos grupos de rodopsina puede explicarse por evolución convergente o por origen común. En este caso, el origen común parece ser más plausible que la evolución convergente. Según la matriz PAM, el triptófano es el aminoácido menos mutable y la tirosina es el quinto aminoácido menos mutable [23].

4.2. La intrincada historia evolutiva de las rodopsinas metazoarias

Solo hay un gen de rodopsina que se encuentra en el gusano de la bellota, mientras que hay 35 genes de rodopsina que se encuentran en el pez cebra. Ningún gen de rodopsina encontrado en esponjas y nematodos indica que la rodopsina no es esencial para la supervivencia de los metazoos. Sin embargo, la capacidad de fotorrecepción otorga a los animales una gran ventaja para su supervivencia. La no esencialidad y la ventaja para la supervivencia hacen que la evolución de las rodopsinas de los metazoos sea un proceso de nacimiento y muerte, en el que el evento de duplicación de genes crea nuevos genes y algunos genes recién creados se mantienen en el genoma mientras que otros desaparecen del genoma acumulando mutaciones deletéreas [42]. Este proceso condujo a varios genes de rodopsina en diferentes especies de metazoos, por ejemplo, el piojo del cuerpo tiene tres genes de rodopsina diferentes, mientras que el mosquito de la malaria tiene nueve, y ambos son insectos. También hizo que la divergencia y subfuncionalización fuera desenfrenada entre los genes de rodopsina duplicados. Hay al menos diez subgrupos diferentes de rodopsinas metazoarias, y sólo un subgrupo funciona directamente como opsinas visuales [11, 18-21]. El proceso de nacimiento y muerte produjo una historia evolutiva muy complicada para las rodopsinas metazoarias. Debido a su intrincada historia evolutiva y al gran número de secuencias utilizadas en el análisis filogenético, no pudimos adquirir un árbol filogenético preciso para todas las rodopsinas metazoarias. Entonces, en la inferencia de estados ancestrales, usamos los genes de rodopsina de cada especie para realizar análisis filogenéticos con el fin de construir un árbol confiable dentro de cada especie de metazoos.

4.3. Duplicación de genes y transferencia horizontal de genes en rodopsinas microbianas

La duplicación de genes y la transferencia horizontal de genes son comunes en las rodopsinas microbianas. Dos especies microbianas tienen cuatro genes de rodopsina, cinco especies tienen tres genes de rodopsina y once especies tienen dos genes de rodopsina (Tabla complementaria 1). Tanto la duplicación de genes como las transferencias de genes horizontales contribuyen a múltiples copias de rodopsina en estas especies. Por ejemplo, bacteria Salinibacter ruber M8 tiene cuatro genes de rodopsina. Sus dos rodopsinas sensoriales (Bac_Sal_s1 y Bac_Sal_s2) fueron el resultado de un evento de duplicación de genes, pero están agrupadas con archaea rodopsinas en un árbol microbiano. Esto significa que Salinibacter ruber M8 obtuvo su rodopsina sensorial original de arqueas a través de la transferencia horizontal de genes. La transferencia horizontal de genes hace imposible rastrear el origen de las rodopsinas microbianas. El hecho de que los tres dominios de la vida tengan rodopsinas microbianas sugiere que la rodopsina microbiana es un gen muy antiguo. Podría ser tan antiguo como la vida misma.

4.4. ¿Son las rodopsinas metazoarias y las rodopsinas microbianas genes homólogos?

El objetivo principal de este estudio es responder a la pregunta: ¿son las rodopsinas metazoarias y las rodopsinas microbianas genes homólogos? Debido a la falta de evidencia directa: homología de secuencia, intentamos responder a esta pregunta comparando sus estados ancestrales. La complicada historia evolutiva de las rodopsinas metazoarias hizo difícilmente posible un árbol filogenético general confiable. Eludimos este problema construyendo el árbol filogenético para las rodopsinas metazoarias dentro de cada especie. Luego, utilizando estos árboles confiables, inferimos un estado ancestral para cada especie de metazoos.

En nuestros 24 estados ancestrales de la rodopsina metazoaria, más de la mitad de ellos están relacionados de manera divergente con el estado ancestral de la rodopsina microbiana con significación estadística y menos de la mitad de ellos sin significación estadística (Tabla 2). Hay dos posibles explicaciones de la razón por la cual los otros 11 estados ancestrales de la rodopsina metazoaria no muestran significación estadística:

el proceso de nacimiento y muerte eliminó algunas rodopsinas metazoarias basales en estas especies. Por lo tanto, sus árboles filogenéticos solo nos permitieron rastrear hasta un estado ancestral reciente en lugar de uno mucho más antiguo.

en estas especies, las rodopsinas metazoarias existentes divergen tanto de su ancestro que no queda información rastreable en sus secuencias. Estas dos explicaciones no se excluyen mutuamente.

En el caso de trece estados ancestrales de la rodopsina metazoos relacionados de manera divergente con los estados ancestrales de la rodopsina microbiana con significación estadística, ¿significa que la rodopsina metazoica y la rodopsina microbiana son genes homólogos? Según la definición de la prueba de Fitch, la respuesta es sí. La región de prueba que seleccionamos tiene un total de 86 aminoácidos. Dentro de la región de prueba, la distancia de mutación promedio entre el metazoo existente y la rodopsina microbiana son mutaciones en las posiciones del primer y segundo codón. Suponiendo que una mutación en la posición del primer o segundo codón cambiaría su aminoácido codificante, cada codón emparejado en la región de prueba comparte de media aproximadamente 1,38 mutaciones entre dos grupos de rodopsina. Explica por qué no podemos encontrar una homología de secuencia claramente detectable entre las rodopsinas microbianas y metazoarias. Después de la reconstrucción del estado ancestral, la distancia de mutación más corta entre los estados ancestrales microbianos y metazoarios fue de 63 mutaciones. Se encuentra entre el pollo y un estado ancestral microbiano inferido en nueve rodopsinas microbianas, con un

valor de 0,0045. Hay un total de 86 aminoácidos en la región de prueba. Si las mutaciones se distribuyeran uniformemente en cada codón, habría 63 diferencias de aminoácidos entre los estados ancestrales microbianos y metazoarios. En otras palabras, la identidad de secuencia entre los estados ancestrales microbianos y metazoarios sería de 23 aminoácidos. 23 dividido por 86, es aproximadamente un 26,7% de identidad de secuencia.

En el alineamiento de secuencias por pares, más del 30% de identidad de secuencia es el estándar seguro para proteínas homólogas. Las proteínas que comparten entre el 15% y el 30% de identidad de secuencia se encuentran en la zona de penumbra, lo que significa que su estado homólogo sigue siendo ambiguo [22]. Incluso cuando se remonta en el tiempo mediante la reconstrucción de estados ancestrales, nuestro resultado muestra que solo el 26,7% de identidad de secuencia podría existir en cuatro hélices entre las rodopsinas microbianas ancestrales y metazoarias. Desde el punto de vista convencional, tal resultado todavía no puede probar que los metazoos y las rodopsinas microbianas sean proteínas homólogas. Utilizando Hidra rodopsina como un grupo externo, solo podemos inferir estados de rodopsina ancestrales metazoarios tan temprano como en ancestros bilaterianos. Los registros fósiles muestran que el animal bilateriano más antiguo apareció hace unos 580 millones de años [43]. Sin embargo, basándose en la estimación de genes nucleares, la divergencia temprana de los metazoos se remonta a hace 830 millones de años [44]. No se encuentra ningún gen de rodopsina en la esponja, y la especie de microbio más cercana relacionada con los metazoos en este estudio es el hongo. Cryptococcus neoformans var. neoformans. Así que tenemos un tiempo de divergencia de al menos 250 millones de años entre los estados ancestrales microbianos y metazoarios. Tal divergencia de larga data podría explicar la baja identidad de secuencia entre los estados ancestrales microbianos y metazoarios. Ciertamente, la baja identidad de secuencia también podría explicarse aparentemente por la evolución convergente, lo que significa que el gen de la rodopsina apareció de forma independiente en microbios y Metazoos. Pero nuestro resultado muestra que las rodopsinas microbianas ancestrales y las rodopsinas metazoarias ancestrales compartían aproximadamente un 26,7% de identidad de secuencia en cuatro hélices. Es inverosímil creer que las mutaciones aleatorias crearían una estructura casi idéntica al generar largas cadenas de aminoácidos con secuencias similares.

4.5. La posición de la lisina que se une a la retina en la séptima hélice

La alineación de la estructura de las rodopsinas microbianas y metazoarias muestra un fenómeno intrigante: aunque ambos grupos de rodopsinas tienen una lisina de unión a la retina en la séptima hélice, la posición de esta lisina no se conserva estructuralmente entre ellos (Figura 1). Su posición desplaza tres aminoácidos hacia adelante en las rodopsinas metazoarias. Una vez más, la diferente posición de la lisina de unión a la retina podría explicarse simplemente por la evolución convergente. Sin embargo, la mayoría de las rodopsinas microbianas tienen un ácido aspártico en la posición en que las rodopsinas metazoarias tienen una lisina que se une a la retina. En las rodopsinas microbianas, este ácido aspártico funciona como parte del contraión que equilibra la carga positiva de la lisina de unión a la retina [45, 46]. Dado que las pruebas de alineación de la estructura y del estado ancestral sugieren que las rodopsinas microbianas y metazoarias son proteínas homólogas, esto significa que este ácido aspártico cargado negativamente en la rodopsina microbiana mutado a la lisina de unión a la retina cargada positivamente en la rodopsina metazoica. El código genético del ácido aspártico es GAC o GAT, mientras que el código genético de la lisina es AAG o AAA. Estos dos aminoácidos comparten la misma adenina en la posición del segundo codón. La segunda posición del codón tiende a tener la tasa de mutación más lenta entre las tres posiciones del codón [47]. Es probable que Asp (codificación GAC o GAT) primero haya mutado a Asn (codificación AAC o AAT) y luego Asn haya mutado a Lys (codificación AAG o AAA) durante la evolución del gen de la rodopsina.

La lisina de unión a la retina en la séptima hélice es el aminoácido más crucial para la función de fotorrecepción de la rhodospin. Se une al cromóforo retiniano que es responsable de la absorción de luz [1, 2]. Si las rodopsinas microbianas y metazoarias son proteínas homólogas, su lisina de unión a la retina en diferentes posiciones significa que la función de fotorrecepción se perdió una vez durante la evolución del gen de la rodopsina. En la rodopsina metazoica, la mutación de rescate de esta lisina rescató la función de fotorrecepción en la rodopsina metazoaria. La lisina una vez perdida explica por qué no existe una homología de secuencia claramente detectable entre las rodopsinas microbianas y metazoarias. Durante la evolución de organismos unicelulares a animales multicelulares, el gen de la rodopsina en el antepasado metazoario temprano perdió la lisina de unión a la retina y, por lo tanto, perdió su función de fotorrecepción. La pérdida de función liberó al gen de la rodopsina de la restricción funcional, y el proceso de divergencia cambió rápidamente su secuencia original más allá del reconocimiento. Inexplicablemente, en la evolución posterior de los metazoos, uno de esos genes de rodopsina con pérdida de función logró recuperar una lisina en su séptima hélice a través de una mutación aleatoria y, por lo tanto, rescató su función de fotorrecepción.

5. Conclusión

Con base en nuestro análisis, proponemos que las rodopsinas microbianas y metazoarias son proteínas homólogas y la función de fotorrecepción se perdió una vez durante la evolución del gen de la rodopsina. Esta conclusión puede ser controvertida según la visión convencional de las proteínas homólogas. Lógicamente, la opinión de que las rodopsinas microbianas y metazoarias son proteínas homólogas es la más parsimoniosa. No requiere otra proteína para ser precursora de las rodopsinas metazoarias. La naturaleza acaba de reciclar la proteína de siete hélices transmembrana para la fotorrecepción. Sin embargo, la visión alternativa de que la estructura casi idéntica entre las rodopsinas microbianas y metazoarias es el resultado de la evolución convergente requiere mutaciones aleatorias para crear dos dominios de siete hélices transmembrana mediante la generación de cadenas largas de aminoácidos con secuencias similares. El dominio de siete hélices transmembrana realiza otras funciones además de la fotorrecepción en Metazoa [48]. Forman una gran familia de proteínas de receptores acoplados a proteínas G que incluyen la rodopsina metazoaria y el receptor olfativo. La investigación muestra que la mayoría de estos receptores de siete transmembranas comparten un origen común [49].Es natural que alguien se pregunte cuál fue el origen de todos estos receptores de siete transmembranas. No existe ningún receptor antiguo de siete transmembranas aparte de las rodopsinas microbianas que podrían ser tan antiguas como la vida misma. Para aquellos que creen que la estructura idéntica entre las rodopsinas microbianas y metazoarias es el resultado de una evolución convergente, tendrán que responder a estas dos preguntas: ¿cuál fue el precursor de todos los receptores de siete transmembrana en los metazoos, si tal precursor existió? las mutaciones lo moldean en siete hélices transmembrana mediante la generación de largas cadenas de aminoácidos que también son similares a un subconjunto de rodopsinas microbianas? Por otro lado, nuestra inferencia de estado ancestral no pudo proporcionar una secuencia de identidad decisiva entre las rodopsinas ancestrales microbianas y metazoarias. La identidad de secuencia ambigua podría explicarse por la restricción funcional una vez aliviada y el largo tiempo de divergencia entre microbios y metazoos. La brecha de tiempo de divergencia podría llenarse mediante el uso de genes relacionados con la rodopsina de animales basales para la inferencia de estados ancestrales. Los futuros proyectos de genoma para animales basales podrían tener la respuesta definitiva a la cuestión de la relación evolutiva entre la rodopsina microbiana y la rodopsina metazoica.

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen al Dr. Xun Gu (Universidad de Fudan y Universidad Estatal de Iowa) por sus sugerencias de investigación en esta investigación. Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Programa Nacional de Investigación Básica (2012CB944600), el Ministerio de Ciencia y Tecnología (2011BAI09B00) y la Fundación Nacional de Ciencias de China (30890034).

Materiales complementarios

Tabla complementaria 1: Genes de rodopsina identificados en genomas microbianos.

Tabla complementaria 2: Gen de la rodopsina microbiana relacionado de manera divergente con los estados ancestrales de la rodopsina metazoaria y con cuántos estados ancestrales de la rodopsina metazoaria está relacionado. Aquí 95% cuantil = 15,25.

Figura complementaria 1: árbol de unión de vecinos para todos los genes de rodopsina metazoos. Se basa en el modelo JTT y 4 parámetros Gamma. Los números adyacentes a los nodos del árbol son valores de arranque. Las hidrarodopsinas sirven como grupo externo. Los clados verde, rojo y azul son tres grupos principales en este árbol.

Figura complementaria 2: árbol de máxima verosimilitud para todos los genes de rodopsina metazoos. Se basa en el modelo WAG y 4 parámetros Gamma. Los números adyacentes a los nodos son resultados aproximados de la prueba de razón de verosimilitud. Las hidrarodopsinas sirven como grupo externo. Los clados verde, rojo y azul son tres grupos principales según el árbol de NJ. Se mezclan en el árbol ML.

Figura complementaria 3: árbol bayesiano para todos los genes de rodopsina metazoos. Se basa en el modelo WAG y 4 parámetros Gamma. Los números adyacentes a los nodos son valores de probabilidad posteriores. Las hidrarodopsinas sirven como grupo externo. Los clados verde, rojo y azul son tres grupos principales según el árbol de NJ. Se mezclan en árbol bayesiano.

Figura complementaria 4: árbol bayesiano sin raíces para todos los genes de rodopsina microbiana. Los números adyacentes a los nodos son valores de probabilidad posteriores. La longitud de la rama refleja la divergencia evolutiva. Rama verde significa taxón de arqueas. Rama roja significa taxón eucariota. La rama azul significa taxón de bacterias.

Figura complementaria 5: árbol de máxima verosimilitud sin raíces para todos los genes de rodopsina microbiana. Los números adyacentes a los nodos son resultados aproximados de la prueba de razón de verosimilitud. La longitud de la rama refleja la divergencia evolutiva. Rama verde significa taxón de arqueas. Rama roja significa taxón eucariota. La rama azul significa taxón de bacterias.

Figura complementaria 6: árbol de unión de vecinos sin raíces para todos los genes de rodopsina microbiana. Los números adyacentes a los nodos del árbol son valores de arranque. La longitud de la rama refleja la divergencia evolutiva. Rama verde significa taxón de arqueas. Rama roja significa taxón eucariota. La rama azul significa taxón de bacterias.

Referencias

  1. K. Nakanishi, "11-cis-retinal, una molécula especialmente adecuada para la visión", Química pura y aplicada, vol. 63, págs. 161-170, 1991. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  2. J. L. Spudich, C. S. Yang, K. H. Jung y E. N. Spudich, "Proteínas de retinilideno: estructuras y funciones de arqueas a humanos", Revisión anual de biología celular y del desarrollo, vol. 16, págs. 365–392, 2000. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  3. B. Schobert y J. K. Lanyi, "Halorhodopsin es una bomba de cloruro impulsada por luz", Revista de química biológica, vol. 257, no. 17, págs. 10306–10313, 1982. Ver en: Google Scholar
  4. O. Beja, L. Aravind, E. V. Koonin et al., "Rodopsina bacteriana: evidencia de un nuevo tipo de fototrofia en el mar", Ciencias, vol. 289, no. 5486, págs. 1902-1906, 2000. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  5. O. A. Sineshchekov, K. H. Jung y J. L. Spudich, "Dos rodopsinas median la fototaxis a la luz de baja y alta intensidad en Chlamydomonas reinhardtii", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 99, no. 13, págs. 8689–8694, 2002. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  6. K. H. Jung, V. D. Trivedi y J. L. Spudich, "Demostración de una rodopsina sensorial en eubacterias", Microbiología molecular, vol. 47, no. 6, págs. 1513–1522, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  7. A. Terakita, "The opsins", Biología del genoma, vol. 6, no. 3, artículo 213, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  8. S. A. Waschuk, A. G. Bezerra, L. Shi y L. S. Brown, "Leptosphaeria rhodopsin: bomba de protones similar a la bacteriorrodopsina de un eucariota", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 102, no. 19, págs. 6879–6883, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  9. D. Arendt, K. Tessmar-Raible, H. Snyman, A. W. Dorresteijn y J. Wittbrodf, "Fotorreceptores ciliares con una opsina de tipo vertebrado en un cerebro de invertebrados", Ciencias, vol. 306, no. 5697, págs. 869–871, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  10. M. Koyanagi, K. Kubokawa, H. Tsukamoto, Y. Shichida y A. Terakita, "Melanopsina cefalocordada: vínculo evolutivo entre células visuales de invertebrados y células ganglionares de retina fotosensibles de vertebrados", Biología actual, vol. 15, no. 11, págs. 1065–1069, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  11. M. Koyanagi y A. Terakita, "subfamilia de rodopsina acoplada a Gq compuesta de pigmento visual de invertebrados y melanopsina", Fotoquímica y fotobiología, vol. 84, no. 4, págs. 1024–1030, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  12. I. Provencio, G. Jiang, W. J. De Grip, W. P & # xe4r Hayes y M. D. Rollag, "Melanopsin: an opsin in melanophores, brain, and eye", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 95, no. 1, págs. 340–345, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  13. E. E. Tarttelin, J. Bellingham, M. W. Hankins, R. G. Foster y R. J. Lucas, "Neuropsin (Opn5): una nueva opsina identificada en tejido neural de mamíferos", Letras FEBS, vol. 554, no. 3, págs. 410–416, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  14. S. Blackshaw y S. H. Snyder, "Encefalopsina: una nueva opsina extrarretiniana de mamíferos discretamente localizada en el cerebro", Revista de neurociencia, vol. 19, no. 10, págs. 3681–3690, 1999. Ver en: Google Scholar
  15. M. Jiang, S. Pandey y H. K. W. Fong, "An opsin homologue in the retina and pigment epitelium", Oftalmología investigativa y ciencia visual, vol. 34, no. 13, págs. 3669–3678, 1993. Ver en: Google Scholar
  16. D. Shen, M. Jiang, W. Hao, L. Tao, M. Salazar y H. K. W. Fong, "Un gen relacionado con la opsina humana que codifica una proteína de unión al retinaldehído", Bioquímica, vol. 33, no. 44, págs. 13117-13125, 1994. Ver en: Google Scholar
  17. H. Sun, D. J. Gilbert, N. G. Copeland, N. A. Jenkins y J. Nathans, "Peropsina, una nueva proteína similar a un pigmento visual ubicada en las microvellosidades apicales del epitelio pigmentario de la retina", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 94, no. 18, págs. 9893–9898, 1997. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  18. M. Max, P. J. McKinnon, K. J. Seidenman et al., "Opsina pineal: una opsina no visual expresada en la glándula pineal", Ciencias, vol. 267, no. 5203, págs. 1502–1506, 1995. Ver en: Google Scholar
  19. S. Blackshaw y S. H. Snyder, "Parapinopsin, una nueva opsina de bagre localizada en el órgano parapineal, define una nueva familia de genes" Revista de neurociencia, vol. 17, no. 21, págs. 8083–8092, 1997. Ver en: Google Scholar
  20. A. R. Philp, J. M. García-Fernández, B. G. Soni, R. J. Lucas, J. Bellingham y R. G. Foster, “Opsina antigua (VA) de vertebrados y fotorrecepción extrarretiniana en el salmón del Atlántico (Salmo salar)”, Revista de biología experimental, vol. 203, no. 12, págs. 1925–1936, 2000. Ver en: Google Scholar
  21. P. Moutsaki, D. Whitmore, J. Bellingham, K. Sakamoto, Z. K. David-Gray y R. G. Foster, "Opsina de tejido múltiple teleósteo (tmt): ¿un fotopigmento candidato que regula los relojes periféricos del pez cebra?" Investigación del cerebro molecular, vol. 112, no. 1-2, págs. 135–145, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  22. W. R. Pearson, "Comparación de la secuencia de proteínas y evolución de las proteínas", Tutorial, ISMB2000, 2001. Ver en: Google Scholar
  23. M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz y B. C. Orcutt, "Un modelo de cambio evolutivo en proteínas", Atlas de secuencia y estructura de proteínas, vol. 5, no. 3, págs. 345–352, 1978. Ver en: Google Scholar
  24. W. M. Fitch, "Distinguir proteínas homólogas de proteínas análogas", Zoología sistemática, vol. 19, no. 2, págs. 99-113, 1970. Ver en: Google Scholar
  25. D. Lawson, P. Arensburger, P. Atkinson et al., "VectorBase: un recurso de datos para la genómica de vectores de invertebrados", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 37, no. 1, págs. D583 – D587, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  26. S. F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers y D. J. Lipman, "Herramienta básica de búsqueda de alineación local", Revista de biología molecular, vol. 215, no. 3, págs. 403–410, 1990. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  27. W. R. Pearson y D. J. Lipman, "Herramientas mejoradas para la comparación de secuencias biológicas", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 85, no. 8, págs. 2444–2448, 1988. Ver en: Google Scholar
  28. R. C. Edgar, "MUSCLE: alineación de secuencia múltiple con alta precisión y alto rendimiento", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 32, no. 5, págs. 1792–1797, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  29. C. Guda, S. Lu, E. D. Scheeff, P. E. Bourne e I. N. Shindyalov, "CE-MC: un servidor de alineación de estructuras de proteínas múltiples", Investigación de ácidos nucleicos, vol. 32, págs. W100 – W103, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  30. F. Abascal, R. Zardoya y D. Posada, "ProtTest: selección de modelos de evolución de proteínas que mejor se ajustan", Bioinformática, vol. 21, no. 9, págs. 2104–2105, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  31. K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei y S. Kumar, "MEGA5: análisis de genética evolutiva molecular utilizando métodos de máxima verosimilitud, distancia evolutiva y máxima parsimonia", Biología molecular y evolución, vol. 28, no. 10, págs. 2731–2739, 2011. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  32. S. Guindon, J. F. Dufayard, V. Lefort, M. Anisimova, W. Hordijk y O. Gascuel, "Nuevos algoritmos y métodos para estimar filogenias de máxima verosimilitud: evaluación del rendimiento de PhyML 3.0", Biología sistemática, vol. 59, no. 3, págs. 307–321, 2010. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  33. M. Anisimova y O. Gascuel, "Prueba de razón de verosimilitud aproximada para sucursales: una alternativa rápida, precisa y poderosa" Biología sistemática, vol. 55, no. 4, págs. 539–552, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  34. J. P. Huelsenbeck y F. Ronquist, "MRBAYES: inferencia bayesiana de árboles filogenéticos", Bioinformática, vol. 17, no. 8, págs. 754–755, 2001. Ver en: Google Scholar
  35. J. Felsenstein, "Phylogeny Inference Package (PHYLIP)", versión 3.5., Universidad de Washington, Seattle, Wash, EE. UU., 1993. Ver en: Google Scholar
  36. R. F. Doolittle, "Evolución convergente: la necesidad de ser explícito", Tendencias en ciencias bioquímicas, vol. 19, no. 1, págs. 15-18, 1994. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  37. H. Luecke, B. Schobert, H. T. Richter, J. P. Cartailler y J. K. Lanyi, "Estructura de la bacteriorrodopsina en una resolución de 1,55 A", Revista de biología molecular, vol. 291, no. 4, págs. 899–911, 1999. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  38. K. Edman, A. Royant, P. Nollert et al., "Reordenamientos estructurales tempranos en el fotociclo de un receptor sensorial de membrana integral", Estructura, vol. 10, no. 4, págs. 473–482, 2002. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  39. T. Okada, M. Sugihara, A. N. Bondar, M. Elstner, P. Entel y V. Buss, "La conformación retiniana y su entorno en la rodopsina a la luz de una nueva estructura cristalina de 2.2 A", Revista de biología molecular, vol. 342, no. 2, págs. 571–583, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  40. L. Vogeley, O. A. Sineshchekov, V. D. Trivedi, J. Sasaki, J. L. Spudich y H. Luecke, "Anabaena sensory rhodopsin: a photochromic color sensor at 2.0 A", Ciencias, vol. 306, no. 5700, págs. 1390-1393, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  41. M. Murakami y T. Kouyama, "Estructura cristalina de la rodopsina de calamar", Naturaleza, vol. 453, no. 7193, págs. 363–367, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  42. M. Nei, X. Gu y T. Sitnikova, "Evolución por el proceso de nacimiento y muerte en familias multigénicas del sistema inmunológico de vertebrados", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 94, págs. 7799–7806, 1997. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  43. A. H. Knoll y S. B. Carroll, "Evolución animal temprana: puntos de vista emergentes de la biología y la geología comparadas", Ciencias, vol. 284, no. 5423, págs. 2129–2137, 1999. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  44. X. Gu, "La divergencia de los primeros metazoos fue hace unos 830 millones de años", Revista de evolución molecular, vol. 47, no. 3, págs. 369–371, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  45. T. Marti, S. J. Rosselet, H. Otto, M. P. Heyn y H. G. Khorana, "The retinylidene Schiff base counterion in bacteriorhodopsin", Revista de química biológica, vol. 266, no. 28, págs. 18674–18683, 1991. Ver en: Google Scholar
  46. H. Luecke, B. Schobert, J. Stagno et al., "Estructura cristalográfica de xanthorhodopsin, la bomba de protones impulsada por luz con un cromóforo dual", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 105, no. 43, págs. 16561–16565, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  47. L. Bofkin y N. Goldman, "Variación en los procesos evolutivos en diferentes posiciones de codones", Biología molecular y evolución, vol. 24, no. 2, págs. 513–521, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  48. V. Katritch, V. Cherezov y R. C. Stevens, "Diversidad y modularidad de las estructuras del receptor acoplado a proteína G", Tendencias en ciencias farmacológicas, vol. 33, no. 1, págs. 17–27, 2012. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  49. KJ Nordstr & # xf6m, M. S & # xe4llman Alm & # xe9n, MM Edstam, R. Fredriksson y HB Schi & # xf6th, "Independent HHsearch, Needleman & # x2014 basado en Wunsch, y los análisis de motivos revelan la jerarquía general de la mayor parte de la proteína G -familias de receptores acoplados " Biología molecular y evolución, vol. 28, no. 9, págs. 2471–2480, 2011. Ver en: Sitio del editor | Google Académico

Derechos de autor

Copyright & # xa9 2013 Libing Shen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de atribución de Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original se cite correctamente.


RODOPSINA

Expresión

Los bastoncillos de la retina son neuronas especializadas que funcionan para capturar fotones y comunicarse con neuronas secundarias sobre la presencia de luz. Estos eventos se inician por cambios conformacionales en el pigmento sensible a la luz, la rodopsina, seguidos de una cascada bioquímica de reacciones, denominada fototransducción (30, 31). En la retina de los mamíferos hay & # x0223c10 8 células fotorreceptoras. Los bastones son células altamente diferenciadas con segmentos externos (ROS) que contienen todos los componentes necesarios para la fototransducción. Los ROS se componen de pilas de 1000 & # x020132000 membranas de disco independientes rodeadas por membrana plasmática (Figura 1, consulte Materiales suplementarios: siga el enlace Material suplementario en la página de inicio de Revisiones anuales en http://annualreviews.org/). El componente principal de las membranas del disco es la rodopsina (& # x0003e90% de las proteínas de la membrana). La opsina, el componente proteico de la rodopsina, se expresa específicamente en los fotorreceptores de los bastones de la retina y en algunas células de la glándula pineal (37). En ratones adultos, el 0,06% del ARN retiniano total codifica opsina (los fotorreceptores constituyen & # x0223c80 & # x0201390% de todas las células de la retina) (38). Esto se traduce en la expresión más alta de cualquier GPCR.Se pueden aislar aproximadamente 0,5 & # x020131 mg de rodopsina de una retina bovina.

Empaquetamiento molecular de rodopsina (A) y rodopsina sensorial (B) en sus cristales. Una unidad asimétrica contiene dos moléculas de rodopsina. El dímero central se muestra como una superficie continua, mientras que el resto se muestra como cintas. Las vistas son de diferentes ejes cristalográficos X, Y, Z para la rodopsina (27) y X y Z para la rodopsina sensorial. Los datos de la rodopsina sensorial se tomaron de Protein Data Base (1H68). Coordenadas: Los modelos de rodopsina y los modelos de homología de pigmentos de cono se han depositado en el Protein Data Bank (PDB) (identificadores 1F88, 1HZX, 1KPN, 1KPW, 1KPX).

Purificación

El espectro de absorción de rodopsina en soluciones de detergente muestra dos máximos en la región UV-Vis: la banda de proteína alrededor de 280 nm y el pico relacionado con el cromóforo a 498 nm. La relación de la absorción A280 nm/A498 nanómetro para la rodopsina pura desprovista de opsina es & # x0223c1.6, con un coeficiente de extinción de 42.000 cm & # x022121 M & # x022121 a 498 nm. La rodopsina es estable a temperatura ambiente durante días cuando se extrae en muchos detergentes, incluidos Chaps, dodecil - & # x003b2-maltoside o Tween 80. La fuente más frecuente de rodopsina nativa son los ojos de los bovinos. La rodopsina nativa se pre-purifica inicialmente mediante el aislamiento de ROS de la retina usando un método de gradiente de sacarosa (contenido de rodopsina 50 & # x0201370% en ROS) [revisado en (6)]. Los métodos de purificación requieren la separación de la rodopsina de las proteínas contaminantes y de la opsina blanqueada. Todos los métodos requieren detergente para la solubilización de rodopsina. El primer método aprovecha la glicosilación de rodopsina y emplea cromatografía de afinidad con concanavalina A (39). Un gran porcentaje de opsina se une irreversiblemente a la resina. La cromatografía de concanavalina A es escalable y se pueden preparar grandes cantidades de material, aunque la rodopsina purificada está contaminada con otras glicoproteínas y con concanavalina A, que se filtra de la resina. El segundo método utiliza cromatografía de hidroxiapatita y produce solo proteína parcialmente purificada (40). La rodopsina también se purifica eficazmente mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando el anticuerpo monoclonal 1D4 de Molday, que reconoce de siete a nueve aminoácidos C-terminales de la rodopsina bovina. Este método es particularmente útil para rodopsina expresada heteróloga y otros pigmentos visuales (26, 41). El cuarto método aprovecha la rodopsina altamente enriquecida en ROS y la inestabilidad de la opsina y la proteína contaminante durante la incubación prolongada en un detergente suave en presencia de iones metálicos divalentes (43). Es un método eficaz y escalable que no utiliza columnas cromatográficas. Este método también enriquece las preparaciones de rodopsina con lípidos ROS nativos y produce rodopsina altamente concentrada con concentraciones controlables de detergente adecuado para estudios de cristalización. Este método no es aplicable a sistemas heterólogos debido a los bajos niveles de expresión de rodopsina.

Composición

La rodopsina está compuesta por una apoproteína transmembrana, opsina y 11-cis-retinal unido a la proteína a través de un enlace de base de Schiff a una cadena lateral de lisina. Opsina bovina (Swiss-Prot: <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "P02699", "term_id": "129204", "term_text": "P02699" >> P02699) está compuesto por 348 aminoácidos con una masa molecular de 39.007. La masa molecular total aumenta a 42.002 cuando se incluyen modificaciones postraduccionales (palmitoilación, acetilación del extremo N y glicosilación). Los aminoácidos más prevalentes son Phe (8,9%), Val (8,9), Ala (8,3) y Leu (8,0), lo que sugiere un carácter hidrófobo importante para esta proteína.

La rodopsina se modifica ampliamente mediante modificaciones postraduccionales. El cromóforo se une a través de una base de Schiff protonada a Lys 296 (44). La Met N-terminal está acetilada (45), como se encuentra con frecuencia para otras proteínas eucarióticas en su residuo Met de iniciación. Utilizando el marcado ex vivo con [3 H], se demostró que la opsina está palmitoilada (46), una modificación que se observa con frecuencia entre los GPCR. Dos residuos de Cys, Cys 322 y Cys 323, ubicados en el extremo C, están palmitoilados (47). Dos residuos de Cys de la hélice III y E III (el bucle que conecta las hélices IV y V) están reticulados por un enlace disulfuro (48). Dos hombres)3(GlcNAc)3 los grupos modifican la opsina a través de un enlace de asparagina (Figura 2, consulte Materiales complementarios: siga el enlace Material complementario en la página de inicio de Revisiones anuales en http://annualreviews.org/) en el extremo N (Asn 2 y Asn 15) (49) . La glicosilación no es homogénea y se identificaron otras composiciones, pero menores, de los restos de carbohidratos (50). La rodopsina sufre una fosforilación dependiente de la luz en seis a siete residuos de Ser / Thr en el extremo C-terminal (51). In vivo, hay tres sitios, Ser 336, Ser 338 y Ser 343, que se fosforilan por métodos directos y cuantitativos después de un 20% de blanqueo de la proteína (52, 53). Los procesos de fosforilación, en blanqueadores más bajos, como 100 & # x0201310.000 fotones / s por varilla, aún no son accesibles para las tecnologías actualmente disponibles. A estos niveles de lejía, nuestras varillas son funcionales antes de que se saturen con una luz más intensa. Se ha observado in vitro heterogeneidad y fosforilación múltiple de rodopsina [revisado en (54)].

Dibujos de cinta de rodopsina. Las hélices I & # x02013VIII están coloreadas como un espectro de luz visible desde el azul (hélice I) hasta el rojo (hélice VIII), y se muestran dos orientaciones. Cadenas de palmitoilo y grupos de oligosacáridos mostrados usando modelos de bola y palo.

La rodopsina, cuando se aísla de ROS, contiene cantidades variables de fosfolípidos fuertemente unidos. Estos lípidos posiblemente estabilizan la rodopsina y recubren las regiones transmembrana hidrófobas de la proteína. Encontramos, usando fosfolípidos radiactivos, que pueden eliminarse completamente solo en condiciones muy duras, como SDS al 1% en ácido fórmico y trifluoroetanol (1: 1) (X. Zhou & # x00026 K. Palczewski, datos no publicados). Es razonable especular que la integridad de la rodopsina y otras proteínas de la membrana se puede perder al eliminar todos los lípidos estrechamente asociados.

Vía de regeneración y fotoblanqueo

La reacción clave de la excitación visual es la reacción fotoquímica ultrarrápida (femtosegundos) del cromóforo de rodopsina, 11-cis-retinal formando todo-trans-retiniana (55). Desde el punto de vista de la química orgánica teórica, esta isomerización implica muy probablemente el mecanismo & # x0201cHula-Twist & # x0201d que conserva, en una primera aproximación, las posiciones del anillo de & # x003b2-ionona y la base de Schiff (56). Un mecanismo convencional de & # x0201cone-bond-flip & # x0201d predeciría una gran rotación del anillo de & # x003b2-ionona dentro de las moléculas de rodopsina (Figura 3, consulte Materiales suplementarios: siga el enlace Material suplementario en la página de inicio de Revisiones anuales en http: //annualreviews.org/). En milisegundos, se establece la señalización Meta II y esta forma catalíticamente activa de rodopsina se une y activa la transducina (T, Gt).

Modelo bidimensional de rodopsina bovina. Los residuos enterrados se muestran en gris. Naranja, rojo y violeta denotan residuos superficiales. Los residuos en contacto con los grupos de cabezas polares de la membrana en el lado citoplásmico son de color naranja. Los residuos similares en el lado extracelular son rojos. Todos los demás residuos superficiales son violetas.

La fotoisomerización de 11-cis-retinilideno para todos-trans-retinilideno desencadena cambios conformacionales de opsina a través de múltiples intermediarios, como fotorrodopsina, batorrodopsina, lumirodopsina, Meta I, Meta II y Meta III, antes de que el cromóforo se hidrolice y abandone la bolsa de unión (34). Estos intermedios son de corta duración, pero pueden quedar atrapados por la baja temperatura y distinguirse por máximos de absorción específicos en el rango de la luz visible (57). Los pasos finales, a saber, la hidrólisis de todos-trans-retinilideno y su relación con Meta III, son poco conocidos a nivel mecanicista. La hidrólisis de la base de Schiff parece ser el paso que limita la velocidad en la liberación del cromóforo (58). Además, se identificaron dos formas de Meta II, Meta IIa y Meta IIb, que difieren en el estado de protonación en la superficie citoplásmica, mientras que la base de Schiff está desprotonada con una característica & # x003bbmax a 380 nm (59). La forma que activa la transducina es Meta IIb (34).

Gratis todotrans-retinal también se une a la opsina y forma receptores parcialmente activos hacia la activación de la transducina [revisado en (60)]. Esta actividad se mejora en comparación con la actividad de la opsina libre. A partir del modelo cristalográfico, se ha identificado un sitio de unión potencial para la retina en el dominio hidrofóbico de la rodopsina (D.C. Teller, datos no publicados). Para 11-cis-retinal, la unión a este sitio podría ser el primer paso en la regeneración de la rodopsina, antes de que el cromóforo se una de forma no covalente a la cavidad del retinilideno y antes de la formación estable de la base de Schiff (61). En el complejo Meta II-transducina, todos-trans-retinilideno se puede fotoisomerizar de nuevo a 11-cis-retinilideno sin disociación de transducina, lo que sugiere que la proteína G impone cambios conformacionales en la superficie de la rodopsina que no se pueden revertir incluso después de la fotoisomerización (62). Sin embargo, cuando Meta II se fotoliza con luz azul, se forma un producto que tiene propiedades de absorción similares a las de la rodopsina con & # x003bbmax a 500 nm, pero con todostrans-retiniana ligada (63). Estos datos indican que todostrans-retinilideno se puede unir en el segmento transmembrana de la rodopsina en dos conformaciones distintas: una que activa el resto de opsina y otra que lo inactiva.

Mutagénesis

La disponibilidad de secuencias de rodopsina y el desarrollo de técnicas de biología molecular han tenido un impacto tremendo en el sondeo de la estructura de la rodopsina utilizando métodos de mutagénesis y bioquímicos. Los hallazgos de esta investigación se discuten en los párrafos siguientes, donde refuerzan las observaciones y la interpretación de la estructura y función de la rodopsina.

Se introdujo un método general para la expresión y purificación de rodopsina a partir de células de riñón de mono (o humano) (64), células de insectos (65) y diferentes cepas de levadura (66, 67). En particular, nos beneficiamos de estos estudios para comprender la sintonización espectral de la rodopsina. Las retinas en sus formas de base de Schiff absorben en el rango casi ultravioleta (360 & # x02013380 nm, en comparación con & # x0223c320 nm para los retinol). El contraión predicho para la base de Schiff protonada se ha identificado como Glu 113, que está muy conservado entre todos los pigmentos visuales de vertebrados conocidos (68-70). La adición de un protón a la base de Schiff, junto con la ubicación crítica de cargas negativas intramoleculares, da como resultado un cambio bathocrómico en el espectro de absorción a la característica de la rodopsina nativa (500 nm). El contraión en el ambiente hidrofóbico causa un & # x0223c aumento de siete veces en el pKa de la base de Schiff protonada. Por lo tanto, la rodopsina en su entorno nativo tendrá su cromóforo en el enlace de base de Schiff protonado (29).

Se demostró que la glicosilación era prescindible para el plegado y la función adecuados de la rodopsina. Las rodopsinas mutantes que carecen de glicosilación de Asn15 exhibieron un plegamiento deficiente y fueron defectuosas en el transporte a la superficie celular. También eran malos activadores de la transducina, quizás debido a su inestabilidad intrínseca (71). Estos estudios aún no se han extendido a modelos animales de ratón.

Ridge y col. fue pionero en estudios de rodopsina utilizando fragmentos de polipéptidos expresados ​​en células COS. La división de la rodopsina en el segundo y tercer bucles citoplasmáticos condujo a la producción de rodopsinas de dos fragmentos que muestran propiedades similares a las de tipo salvaje (72, 73). Estos estudios, y los estudios previos de proteólisis limitada [revisados ​​en (6)], revelaron varios aspectos importantes de la función de la rodopsina. Por ejemplo, conectar los bucles posteriores II y III tiene solo un pequeño efecto estabilizador sobre la rodopsina, mientras que el cromóforo es crítico para la estabilización de la estructura terciaria. Parece que las hélices I & # x02013III y V & # x02013VII, con la hélice IV conectada a cualquiera de estos dos fragmentos, forman rodopsina activa, lo que sugiere la existencia de dos interacciones intradominio independientes. Estos datos están de acuerdo con otro conjunto de experimentos. La rodopsina conserva su espectro después de una proteólisis extensa de sus asas expuestas por pronasa en membranas nativas o en soluciones detergentes, aunque la rodopsina digerida es más sensible a la temperatura a la desnaturalización (K. Palczewski, datos no publicados).


La genética de las rodopsinas microbianas y las halobacterias.

Sorprendentemente, todo el campo de la investigación de la bacteriorrodopsina se manejó sin técnicas o conceptos genéticos hasta la década de 1980. Los análisis de ADN halobacteriano se llevaron a cabo en la década de 1960 (p. Ej., Moore & amp McCarthy, 1969), y Donn J. Kushner y sus colegas de la División de Biociencias del Consejo Nacional de Investigación (NRC) de Ottawa estudiaron los ribosomas halobacterianos (p. Ej. Bayley & amp Kushner, 1964 Oren, 2002) [debido a su estabilidad, los ribosomas de halófilos como Halobacterium marismortui (ahora Haloarcula marismortui, ver Oren et al., 1990) han jugado un papel importante en la determinación de la estructura ribosómica (por ejemplo, Yonath, 2009)]. Sin embargo, estas publicaciones no influyeron considerablemente en la investigación de la bacteriorrodopsina. El campo se desarrolló por separado de la biología molecular clásica y los primeros años de la ingeniería genética. La genética microbiana ya se había "molecularizado" debido al descubrimiento de la estructura de doble hélice del ADN en 1953 y al conocimiento de la transcripción y traducción, así como a la aparición del ADN recombinante a principios de la década de 1970 (Morange, 1998). La ciencia de las proteínas también se ha visto influenciada por métodos y conceptos estructurales como la cristalografía de proteínas, la hélice α de Pauling y las estructuras de mioglobina y hemoglobina de la LMB de Cambridge (de Chadarevian, 2002). La investigación de membranas (así como muchos otros campos de las ciencias de la vida) adoptó un camino de molecularización diferente al de la genética bacteriana y la biología estructural. En el caso de la ciencia de la bacteriorrodopsina temprana, todo el programa de investigación, incluido el cultivo Halobacterium, la preparación de la membrana púrpura y el análisis de las propiedades estructurales, bioquímicas y fisiológicas de la proteína, se llevó a cabo como si Halobacterium era un organismo sin genes ni aparato genético.

Se podría sospechar que varios factores están detrás de la lenta importación de la genética en la investigación de membranas. En primer lugar, condiciones como la alta fuerza osmótica de los medios o la falta de resistencia a los antibióticos comunes deben haber afectado la adaptación de las técnicas de genética molecular. Sin embargo, para comprender por qué la investigación molecular sobre halófilos podría prosperar sin estas tecnologías, es necesario tener en cuenta otra característica de estos organismos, a saber, el hecho de que Halobacterium es extremadamente fenotípicamente variable. Las colonias cambian su apariencia de diferentes tonos de rosa, rojo o naranja a blanco, o de opacas a translúcidas, dependiendo de condiciones como la concentración de luz o sal, así como "espontáneamente" (Larsen, 1973 Oren, 2002). En contraste con los problemas de taxonomía, la variabilidad de Halobacterium tenía algunas ventajas para los estudios moleculares. Aunque fue difícil aislar, estandarizar, almacenar y distribuir las cepas, se podían obtener fácilmente variantes de rasgos morfológicos o fisiológicos colocando en placas o sometiendo los cultivos a ciclos de congelación-descongelación. La tension Halobacterium halobium R1, que fue la base del aislamiento de bacteriorrodopsina, fue un mutante espontáneo. El equipo de Stoeckenius había recibido inicialmente una tensión de H. halobio del NRC en Ottawa, donde Norman Gibbons y sus colegas de la División de Biología Aplicada habían estudiado durante mucho tiempo la fisiología del organismo (Murray, 1978). De esta población, el grupo Stoeckenius simplemente recogió colonias de un color rojo más profundo y apariencia translúcida (causada por la falta de vacuolas de gas) y las utilizó para su proyecto de membrana (Stoeckenius & amp Kunau, 1968). Otras cepas que diferían en su cantidad de bacteriorrodopsina o su estabilidad fueron luego aisladas de H. halobio R1 por mutagénesis química y exámenes de detección (Stoeckenius et al., 1979). Toda la investigación de bacteriorrodopsina en estas cepas podría llevarse a cabo sobre la base de rasgos fenotípicos, sin ninguna especificación del genotipo o mapas genéticos.

El éxito del campo y la gran cantidad de datos valiosos generados muestran que la genética no era necesaria para estudiar la bioquímica y la biofísica de la bacteriorrodopsina. Las cepas cuidadosamente seleccionadas, mantenidas y criadas produjeron cantidades suficientes de la membrana púrpura. La falta de vacuolas de gas facilitó la depuración bioquímica. En términos generales, este episodio de investigación de membranas podría denominarse "biología molecular sin genética". Con esto queremos decir que el conocimiento sobre la genética real del organismo no era estrictamente necesario para su análisis en términos de moléculas. Sin embargo, aunque la investigación con bacteriorrodopsina se desarrolló inicialmente de manera más o menos independiente y en paralelo a la genética molecular, la introducción de técnicas genéticas en la década de 1980 cambió significativamente el camino de la investigación en este campo.

En 1979, el aislamiento de un gran plásmido de H. halobio fue informado (Weidinger et al., 1979). Variaciones fenotípicas bien conocidas, como la presencia de vacuolas de gas o la membrana púrpura, se mapearon en inserciones, reordenamientos o deleciones de ADN plasmídico (Pfeifer et al., 1981). Por primera vez, se dio una explicación genética molecular para la variabilidad de Halobacterium. La investigación genética fue ampliada por el grupo de H. Gobind Khorana en el MIT, que había comenzado a centrarse en la bacteriorrodopsina. La inactivación fenotípicamente detectada de la síntesis de bacteriorrodopsina se correlacionó con un elemento transponible insertado en un sitio específico del genoma (Simsek et al., mil novecientos ochenta y dos). Este descubrimiento se basó en el hallazgo del grupo de Khorana de un gen específico que codifica la bacteriorrodopsina (Dunn et al., 1981). Fundamental para este estudio, que involucró técnicas de ADNc, fue la determinación de la secuencia de aminoácidos de la bacteriorrodopsina. Este proyecto fue llevado a cabo tanto por el grupo de Khorana como por un equipo liderado por el bioquímico soviético, Yuri Ovchinnikov (Khorana et al., 1979 Ovchinnikov et al., 1979). Estos primeros estudios genéticos se llevaron a cabo dentro de otro período de cambio importante impulsado molecularmente en Halobacterium investigar. En 1980, Carl Woese y sus colegas asignaron el género al reino de las arqueobacterias, que habían distinguido de las eubacterias mediante análisis de homología de secuencia de ARNr (Fox et al., 1980). Estudios filogenéticos posteriores de Halobacterium produjo una comprensión evolutiva más detallada de la biología de estos organismos (Sapienza & amp Doolittle, 1982).

A mediados de la década de 1980, la investigación sobre rodopsinas microbianas había experimentado muchos cambios importantes y estas proteínas se examinaban cada vez más utilizando las herramientas de la genética molecular. Una caracterización funcional de la bacteriorrodopsina por mutagénesis, por ejemplo, fue uno de los logros más importantes que se esperaban de la fusión de la investigación de la rodopsina microbiana y la genética molecular (Lo et al., 1984). Sin embargo, Halobacterium La genética todavía carecía de algunas de las herramientas utilizadas en organismos como Escherichia coli. Debido a que vectores como fagos o plásmidos conjugativos no estaban disponibles para Halobacterium, era imposible introducir fragmentos de ADN en forma de alelos mutados de genes de rodopsina en el genoma del organismo. Cualquier estudio de mutaciones tuvo que realizarse de forma heteróloga en E. coli. El desarrollo de vectores lanzadera para especies de Halobacterium a finales de la década de 1980 proporcionó un medio para este tipo de manipulación (Lam & amp Doolittle, 1989).

El seguimiento de la historia de la investigación de la rodopsina microbiana arroja luz sobre las contribuciones de campos muy diferentes a la investigación de membranas. Mientras que la investigación de la bacteriorrodopsina había comenzado con estudios de la proteína en su estado cristalino y fue seguida mucho más tarde por estudios de la organización genética del organismo, otras formas de investigación del transporte de membranas se desarrollaron de manera diferente. El transportador de maltosa y las permeasas de lactosa e histidina, por ejemplo, se descubrieron en organismos genéticos modelo como E. coli o Salmonella typhimurium en la década de 1950. En consecuencia, estos transportadores de membrana fueron conocidos primero por su localización y organización genética en el cromosoma. Luego se caracterizaron mediante la detección de fenotipos anómalos como la deficiencia del transporte, la desregulación o la absorción de otros sustratos (Schwartz, 1987 Guan & amp Kaback, 2006). Las proteínas reales responsables de las funciones fisiológicas se aislaron y caracterizaron solo mucho más tarde, algunas no hasta la década de 1990. Las estructuras cristalinas recién se están publicando (por ejemplo, Oldham et al., 2007). Estas vías paralelas de investigación en transporte de membrana en general y bacteriorrodopsina específicamente comenzaron a fusionarse en la década de 1990 con el advenimiento de herramientas de ADN recombinante más ampliamente utilizables, así como cromatografías de afinidad y técnicas de imágenes biofísicas [otras técnicas de biología de membranas, como electroforesis en gel SDS, también fueron cruciales (Vinothkumar & amp Henderson, 2010)].


Discusión

Recientemente, el diseño racional de las proteínas de unión a la retina ha enfatizado la importancia de la geometría del sitio activo para formar una base de Schiff protonada (18, 19). La reingeniería exitosa de la proteína de unión al ácido retinoico celular II requirió la orientación adecuada del grupo Lys & # x003b5-amino en relación con el centro carbonilo de 11-cis-retinal para ataque nucleofílico. Sin embargo, describimos cuatro posiciones diferentes de Lys que son capaces de unirse a la retina (G90K, T94K, S186K y F293K). Cada una de estas posiciones alternativas obliga al Lys a reaccionar con la retina desde ángulos drásticamente diferentes, lo que indica que los ángulos ideales B & # x000fcrgi & # x02013Dunitz y Flippin & # x02013Lodge no son necesarios para la formación de la base de Schiff en la rodopsina. Este resultado quizás no sea del todo sorprendente, porque los ángulos B & # x000fcrgi & # x02013Dunitz y Flippin & # x02013Lodge se describieron originalmente para dos moléculas que chocan en solución, no mantenidas en una orientación específica por un andamio proteico.

Las mutaciones de Lys también pueden proporcionar información sobre el mecanismo de activación de la rodopsina. En los modelos actuales, el movimiento de TM5 y TM6 está relacionado con un desplazamiento correspondiente de la hoja & # x003b2 que conecta TM4 y 5 (EL2) (5, 20). En el mutante funcional K296A / S186K, la base de Schiff se encuentra en EL2. Si la activación implica el movimiento de EL2 alejándose de la retina en el bolsillo de unión, debe haber una plasticidad considerable en el sitio activo, de modo que los reordenamientos estructurales menores se acomoden fácilmente mediante el mecanismo que conduce al cambio conformacional global de la rodopsina activa.

Sorprendentemente, varias mutaciones de Lys de segundo sitio suprimen la actividad constitutiva de los padres K296G y K296A (Fig. 4). Con la excepción de K296A / S186K, la actividad constitutiva de todos los mutantes Lys se reduce dentro del error experimental del hospedador N2C / D282C. Las mutaciones de segundo sitio que revierten la actividad constitutiva de una rodopsina funcional son raras. Estos resultados son consistentes con un modelo en el que un determinante clave de la actividad constitutiva es la neutralización de la carga en el residuo del contraión de la base de Schiff, Glu113.

El mutante K296G / F293K forma un pigmento con 11-cis-retiniana y activa la transducina, pero la actividad no depende de la luz. La forma de apoproteína, por el contrario, no activa la transducina. Por tanto, la mutación K296G / F293K suprime la actividad constitutiva del padre K296G y permite que la proteína forme una base de Schiff protonada con la retina, pero una vez que la retina se une, la proteína se bloquea en una conformación activa. Este comportamiento es significativamente diferente del del mutante de rodopsina activo oscuro E113Q / M257Y previamente informado (21). Individualmente, las mutaciones E113Q y M257Y activan constitutivamente la rodopsina. El doble mutante también es constitutivamente activo pero, además, muestra una actividad oscura que no se ve con ninguna mutación única sola. La actividad oscura de este mutante probablemente resulta del desacoplamiento conformacional del dominio de activación de la transducina y el sitio de unión a la retina. Por el contrario, la apoproteína K296G / F293K está inactiva pero queda atrapada en una conformación activa después de unirse a la retina. De esta manera, K296G / F293K recuerda al mutante T118W & # x0201csteric & # x0201csteric & # x0201d descrito por Kono y compañeros de trabajo (22). La rodopsina se activa transitoriamente en el proceso de unión a la retina, como si la proteína adoptara una conformación activa mientras se abre para permitir que el ligando entre en el bolsillo de unión (23 & # x0201325). En el mutante T118W, cambiar Thr118 a una cadena lateral más voluminosa da como resultado un choque estérico con el grupo 9-metilo de la retina, lo que evita el cierre del bolsillo de unión y atrapa la proteína en una conformación activa. Quizás la actividad oscura del mutante K296G / F293K resulta de manera similar de un choque estérico debido a un ligero reposicionamiento del cromóforo.

Los mutantes K296G / A117K y K296A / A117K merecen un comentario. Estudios previos de mutagénesis indicaron que un residuo ácido (Asp o Glu) en la posición 117 puede sustituir al contraión de la base de Schiff (26, 27). Por tanto, incluso antes de que la estructura cristalina de la rodopsina confirmara que Ala117 es una vuelta helicoidal de Glu113, los métodos indirectos habían demostrado que Ala117 está cerca del nitrógeno de la base de Schiff. Además, el mutante E113A / A117E forma un intermedio MII protonado tras la exposición a la luz (28), lo que demuestra que la cadena lateral 117 está cerca del nitrógeno base de Schiff tanto en el estado excitado como en el estado fundamental (u oscuro) de la proteína. . En el presente estudio, intentamos mover la base de Schiff Lys de la posición 296 en TM7 a la posición 117 en TM3, pero el mutante es incapaz de formar un pigmento con 11-cis-retiniana (Fig. 2). La incapacidad de formar un pigmento podría indicar simplemente que la proteína mutante no se pliega correctamente. Sin embargo, en el mutante A117K, el contraión Glu113 puede estar tan cerca del grupo Lys & # x003b5-amino que el nitrógeno permanece protonado, incapaz de proporcionar un solo par de electrones para el ataque nucleofílico en el carbono carbonilo de la retina. Esta interpretación está respaldada por el alto rendimiento de proteína de la columna de inmunoafinidad, porque la rodopsina desnaturalizada generalmente se retiene en la columna en nuestras condiciones de purificación (29, 30). La proximidad cercana de la base de Schiff y Glu113 también es consistente con la pérdida de actividad constitutiva en este mutante (Fig. 4) (14).

¿Es el residuo de Lys del sitio activo altamente conservado en TM7 de las rodopsinas de tipo I y tipo II una consecuencia de la evolución convergente debido a una restricción funcional compartida en dos familias de proteínas no relacionadas? Si es así, no debería ser factible mover la Lys del sitio activo a otra ubicación en la proteína y retener la capacidad de formar un pigmento funcional con la retina. De hecho, pudimos construir múltiples pigmentos funcionales de tipo II en los que el sitio activo Lys se mueve a tres posiciones diferentes en diferentes elementos de la estructura secundaria. Por lo tanto, la función de la rodopsina fotosensible no requiere un enlace de base Lys-retinal Schiff en TM7. Estos resultados apoyan la homología de las rodopsinas de tipo I y de tipo II al demostrar que la posición de la base de Schiff compartida no es un producto de la convergencia debido a la restricción funcional.

La evolución ha optimizado las rodopsinas de tipo II modernas durante millones de años, independientemente de si las rodopsinas de tipo I y II son convergentes o divergentes. A diferencia de las rodopsinas naturales, hemos realizado pocos esfuerzos para optimizar la función de nuestras construcciones mutantes, aparte de las mutaciones de fondo N2C / D282C que confieren cierta estabilidad a la proteína. Es plausible que podamos encontrar otras mutaciones compensatorias que mejorarían la función de nuestros mutantes. Por ejemplo, otras mutaciones podrían suprimir la baja actividad constitutiva de K296A / S186K o podrían desplazar al rojo el máximo de absorbancia de los mutantes en 10 nm. Asimismo, es posible que, digamos, el mutante K296A / S186K no tenga actividad constitutiva en un fondo de proteína diferente de otra especie. Hemos probado posiciones de Lys alternativas en una sola proteína de una especie. En cualquier caso, la evolución convergente puede acceder a todas estas posibles variantes (diferentes antecedentes proteicos y mutaciones compensatorias). El hecho de que nuestra cruda mutagénesis haya encontrado tan fácilmente ubicaciones alternativas funcionales de Lys y que, evidentemente, la naturaleza no lo haya hecho, subraya aún más la inverosimilitud de la convergencia evolutiva a la misma ubicación de Lys en la hélice siete.

En resumen, hemos probado la hipótesis de que la función de la rodopsina (en términos de unión a la retina, formación de un pigmento de longitud de onda larga y activación de transducina) restringe el sitio activo Lys a una ubicación en TM7. Los mutantes demuestran claramente que la rodopsina puede conservar la función cuando el Lys se traslada a una ubicación diferente. Estos resultados apoyan un escenario evolutivo divergente en el que un ancestro común dio lugar a las proteínas modernas de retinilideno. Uno podría preguntarse por qué el Lys del sitio activo no ha migrado a otros lugares durante la evolución divergente. La reubicación de Lys probablemente requeriría un intermedio sin Lys de sitio activo o con residuos de Lys en ambas ubicaciones. Quizás el Lys se ha retenido en TM7 porque ninguno de estos intermedios es capaz de formar un pigmento viable.


Evolución: ¿la tienen los ojos?

Charles Darwin expresó su asombro a la vista y se preguntó si no podría ser explicado por la evolución por selección natural, entonces su teoría sería declarada falsa. Desde entonces se ha escrito mucho sobre escenarios de evolución del ojo. En los moluscos está representada una serie de ojos muy plausible que podría corresponder a etapas en la evolución desde la cámara estenopeica en el nautilus hasta el ojo de la cámara del pulpo que rivaliza en complejidad con el ojo de los vertebrados. El ojo ha vuelto a aparecer en los debates sobre Diseño Inteligente.

La caja negra de Darwin acepta el desafío (Behe 1996). Si bien reconoce que la evolución anatómica del ojo puede explicarse por la evolución gradual, el autor concluye que la secuencia de reacciones necesarias para convertir la absorción de fotones por la rodopsina en un impulso nervioso y restaurar la rodopsina es un ejemplo de complejidad irreducible. Quizás el libro de Behe ​​sea engañoso al sugerir que la secuencia de reacción en los ojos tuvo que evolucionar desde cero, porque existen vías similares para otras vías sensoriales-neuronales; sin embargo, Behe ​​sin duda sostendría que una vía antecedente dejaría el origen de la primera vía sensorial compleja. camino por explicar y que sería irreductiblemente complejo.

Los críticos del diseño inteligente afirman que el ojo de los vertebrados muestra un diseño deficiente, en comparación con el ojo de pulpo, porque la luz en el primero debe pasar a través de las células ganglionares antes de llegar a las células fotorreceptoras en la parte posterior de la retina, mientras que el segundo tiene fotorreceptores en la parte frontal de la retina. la retina, directamente en el camino de la luz. Los escépticos podrían sugerir que un mal diseño significa que no hay Dios o uno que deja causas secundarias para terminar Su obra por Él. Parece demasiado especulativo sugerir que, por lo tanto, el hombre, la supuesta corona de la creación, fue defraudado porque no ve tan bien como el pulpo.

Evolución y genética del ojo

Además de los ojos en forma de cámara que se ven en los moluscos cefalópodos, como el pulpo, y en los vertebrados, los órganos visuales también incluyen los familiares ojos compuestos de insectos y otros artrópodos. Al observar la evolución de los ojos en los organismos vivos, algunos organismos unicelulares tienen sensores de luz bien desarrollados y los ojos aparecieron poco después de la evolución del reino animal. Curiosamente, incluso algunas medusas de caja (Phylum Cubozoa) del grupo primitivo radialmente simétrico tienen ojos con lentes bien desarrollados (Nilsson et al. 2005). Los ojos aparecen en los animales simétricos bilateralmente en la rama de invertebrados protóstomos, incluidos el Phylum Arthropoda (animales con patas articuladas), Annelida (gusanos segmentados) y Mollusca (bivalvos, caracoles y cefalópodos). Por supuesto, los ojos son característicos de los vertebrados del grupo deuterostoma.

En un libro dedicado al tema de la evolución del ojo, Andrew Parker (2003) sugirió que la repentina capacidad de ver fue la chispa de la Explosión Cámbrica, pero Simon Conway Morris (2003a) lo reprendió. Conway Morris afirmó que los ojos evolucionaron muchas veces en muchos pasos. Si Parker está en lo cierto, entonces el ojo evolucionó temprano en el Cámbrico, y luego desencadenó una evolución extremadamente rápida en varios filos, los más grandes de los cuales exhiben ojos. Según Parker, el registro fósil indica que los ojos formadores de imágenes probablemente evolucionaron primero en los artrópodos, probablemente trilobites (Parker 2003). En la mayoría de los phyla, aunque la fotorrecepción simple está presente casi universalmente, no evolucionaron ojos, pero los ojos evolucionaron más tarde en Annelida, Mollusca, Onychophora y Chordata. Conway Morris considera que los ojos son un factor, pero no un factor especialmente importante en la rápida evolución del Cámbrico temprano.

Se han mantenido dos puntos de vista con respecto a la evolución del ojo. Gehring (2005) es un destacado defensor de un origen único (origen monofilético) de gran parte del aparato genético constructor de ojos con una evolución divergente posterior. En apoyo de un solo origen de ojos hay datos genéticos que muestran que un gen de mamífero puede causar que se formen ojos en insectos. Según este modelo de divergencia, uno o unos pocos "genes oculares" ancestrales, por ejemplo el gen regulador Pax6, evolucionaron en la bilateria ancestral, dando como resultado la primera mancha ocular. El ojo ancestral luego evolucionó a varios ojos tipo cámara (probablemente de forma independiente) y varios ojos compuestos. Por lo tanto, los filos sin ojos están degenerados o no desarrollan más manchas oculares.

La segunda vista expone múltiples orígenes para los ojos (origen polifilético). Un conjunto de genes más básico permitió que múltiples orígenes convergieran en unos pocos tipos básicos de ojos. Sobre la base de la filogenia molecular, otros investigadores (Oakley y Cunningham 2002) han demostrado que los ojos compuestos emparejados de algunos camarones de semillas evolucionaron dentro de un grupo de Ostracoda que de otro modo sería sin ojos. Los ojos de otros crustáceos, en particular la Malacostraca (cangrejos, cangrejos de río, langostas) evolucionaron de forma independiente. Según este punto de vista de la convergencia, el animal ancestral tenía varios genes, incluidos genes reguladores y genes de opsina, y que el factor clave en el desarrollo del ojo no era la presencia o ausencia de genes, sino un equilibrio de muchos genes reclutados de diversas formas para formar el ojo tipo cámara independientemente en tres o cuatro linajes distintos y ojos compuestos en varios linajes independientemente (Conway Morris 2003b).

Fernald (2006) ofrece una descripción general de la evolución del ojo desde un punto de vista genético, discutiendo las tres familias de proteínas más asociadas con los ojos: opsinas, cristalinas y genes reguladores que codifican factores de transcripción. El pulpo y el antepasado común vertebrado ocurrieron hace unos 750 millones de años. Aproximadamente el 70% de los genes oculares se expresan comúnmente en vertebrados y pulpos, y se estima que el 97% de estos se produjeron en el bilateriano ancestral. Afirmó que se conservaron 875 genes que podrían tener una red reguladora común reclutada al menos dos veces. Los vertebrados usan opsina ciliar en las células fotorreceptoras, mientras que los invertebrados usan opsina rabdomérica. Fernald afirmó que se han reclutado regularmente ciertos factores de transcripción para construir ojos. "El uso de genes homólogos para construir estructuras no homólogas puede estar en el centro de la comprensión de la evolución del ojo y los procesos evolutivos de manera más general". Los ojos pueden haber evolucionado de forma independiente 40 o más veces (Fernald 2006, p. 1917).

Las opsinas ciliares de los vertebrados pueden ser introducidas por la función bien estudiada de la rodopsina que se encuentra en los fotorreceptores llamados bastones. La luz pasa a través del segmento interno conectado por cilios modificados al segmento externo que tiene pilas de membranas. Las membranas están tachonadas con muchas copias de la proteína opsina, cada una unida a una molécula de 11-cis retinal. La retina absorbe la luz y cambia de forma, lo que provoca un cambio de forma en la opsina, lo que lleva a que se transmita un impulso nervioso al cerebro. La retina debe volver a su forma original antes de que pueda absorber más luz. Las opsinas de cono también tienen retina pero se diferencian de la rodopsina y entre sí por algunos aminoácidos en su secuencia.

Las opsinas de cono humano absorben al máximo el rojo a 558 nm, el verde a 531 nm y el azul a 419 nm. Okano y col. (1992) encontraron que la retina de pollo contiene cuatro cono de opsinas y rodopsina. El rojo de pollo se absorbe a 571 nm, el verde a 508 nm, el azul a 455 nm y el violeta a 415 nm. El verde de pollo es similar a las rodopsinas de vertebrados que absorben una longitud de onda de 500 nm. Sugirieron que la opsina ancestral evolucionó a partir de duplicaciones de genes en cuatro opsinas, como se representa en el pollo. Las rodopsinas vertebradas divergieron de la opsina del cono verde más tarde, después de la divergencia del pigmento ancestral en cuatro grupos. Los animales habían adquirido la capacidad de ver los colores al menos en la etapa de los vertebrados inferiores, pero más tarde la mayoría de los mamíferos perdieron la visión de los colores.

Yokoyama (1997) describió cambios en la secuencia de aminoácidos específicos del sitio que cambian la especificidad de la longitud de onda en las opsinas. El artículo también describió la visión de cono dicromático de los monos del nuevo mundo que normalmente resulta de dos genes de opsina diferentes. Los monos del viejo mundo son tricromáticos. La opsina roja humana evolucionó a partir de la opsina verde mediante tres cambios de aminoácidos.

Arendt y col. (2004, p. 869) informaron del descubrimiento de una opsina ciliar en un invertebrado, el gusano de trapo Platynereis. Este gusano tiene opsina rabdomérica en su retina, como se esperaba para un invertebrado, pero opsina ciliar, similar a la de los vertebrados, en su cerebro.Los autores declararon que "cualquier característica específicamente compartida entre ellos como resultado de su herencia evolutiva común existía necesariamente en el último ancestro común de todos los animales con simetría bilateral". Esta opsina se expresa en estructuras ciliares en el cerebro. Creen que las r-opsinas en los vertebrados persistieron en las células ganglionares de la retina.

Bellingham y col. (2006) informaron del descubrimiento de una melanopsina en las células ganglionares de la retina de pollos que funciona en el ritmo circadiano y el reflejo pupilar a la luz. Los vertebrados no mamíferos tienen dos melanopsinas. Los mamíferos tienen una melanopsina. Los primeros mamíferos perdieron una melanopsina, dos opsinas de cono y fotorreceptores extrarretinianos, coincidiendo con una fase nocturna de la evolución de los mamíferos.

Otra familia de proteínas asociada con el ojo es la familia de las cristalinas, que se encuentra especialmente en el cristalino. Las cristalinas deben existir durante mucho tiempo en alta concentración. Estos pueden haber evolucionado de proteínas estresantes, luego a cristalinas beta, luego a cristalinas gamma, que eran específicas del ojo, quizás originalmente en la retina y finalmente en el cristalino (Wistow et al. 2005). Los mamíferos tienen cristalinas gamma A-F. Los peces tienen cristalinas gamma M. Gamma N pudo haber tenido una función ancestral en la retina, y más tarde fue reclutado para el cristalino. Los lentes altamente acomodaticios de las aves requerían una estructura más suave e incorporaban cristalinas específicas de taxón, a menudo provenientes de enzimas, por lo tanto, "cristalinas enzimáticas". Gamma N puede no ser funcional en humanos o chimpancés.

El más sorprendente de los genes relacionados con el ojo son los genes reguladores, incluido Pax6 y genes relacionados que pueden iniciar el desarrollo del ojo en diversas especies. En Drosophila, siete genes parecen controlar el desarrollo del ojo: sin ojos y gemelos de sin ojos son homólogos de Pax6 sine oculus, ojos ausentes, perro salchicha, ojo desaparecido y optix contribuyen a formar una red compleja.

Gehring (2005) quizás da el caso más fuerte para todos los ojos que evolucionan a partir de un ojo ancestral común. Identificó a Pax6 como un gen de control maestro para el desarrollo ocular y propuso una nueva teoría sobre el origen monofilético de los ojos en la evolución. Pax6 puede inducir ojos ectópicos (en algún lugar que no sea la cabeza) tanto en insectos como en vertebrados. Los genes Pax no solo pueden inducir la formación de ojos ectópicamente en antenas, patas y alas, sino que la Pax6 de ratón causa ojos ectópicos en Drosophila. "Debido a que la evolución de un ojo prototípico es un evento estocástico altamente improbable que no está impulsado por la selección, la hipótesis de un origen polifilético de los ojos, que surge de 40 a 65 veces de forma independiente, es extremadamente improbable e incompatible con las ideas de Darwin" (Gehring 2005 , pág.175). Se han encontrado genes relacionados con Pax6 en toda la bilateria analizada hasta ahora, desde planarias hasta humanos.

Dado que los equinodermos comparten la ascendencia del deuterstome con el Phylum Chordata, es de particular interés examinar el genoma recientemente decodificado del erizo de mar (Sea Urchin Genome Sequencing Consortium 2006). El erizo de mar tiene cientos de genes homólogos a los genes sensoriales de los mamíferos, incluidos los genes oculares. Los genes de los fotorreceptores aparentemente se expresan en los pies del tubo. ¿Realmente un erizo de mar necesita cientos de genes sensoriales sin ojos, oídos ni nariz? Quizás el ancestro del deuterstome desarrolló genes oculares sin ojos, o posiblemente tenía ojos y los perdió, y estos genes se conservaron para un uso diferente en el erizo de mar. O quizás los genes del desarrollo evolucionaron incluso antes de que el protostoma-deuterstome se dividiera hace al menos 750 millones de años, de modo que el erizo de mar compartía un conjunto común de genes comunes a los animales. Estos genes, a veces, en cierto equilibrio, desarrollaron ojos mientras que, en otras ocasiones, se utilizaron para desarrollar estructuras no relacionadas. Kozmik y col. (2007) reportaron nueve genes Pax en anfioxos, que también carecían de ojos, incluidos cuatro homólogos de seis recién descritos y ojos ausentes.

Brodbeck y Englert (2004) informaron que el ratón tiene nueve genes Pax. Muchos de estos mismos genes se utilizan en el desarrollo de riñones de mamíferos. Por tanto, estos genes reguladores exhiben pleiotropía y se expresan en muchos tejidos diferentes. En comparación con Gehring (2005), han sugerido una visión diferente de los genes y jerarquías de control maestro, y prefieren los conceptos de circuitos y redes. "La evolución es conservadora, ya que los componentes de las redes se vuelven a desplegar en diferentes especies y en el desarrollo de diferentes órganos. Al mismo tiempo, la evolución es exploratoria y no volverá a utilizar el mismo módulo, pero probará diferentes combinaciones de factores, incorporará ciclos de retroalimentación adicionales , involucran componentes adicionales y abandonan otros "(Brodbeck y Englert 2004, p. 253).

¿Podría ser que el antepasado de los deuteróstomos era un habitante de la oscuridad que se alimentaba del fondo? Quizás muchos genes se acumularon para otras funciones sensoriales, como se observa en el erizo de mar, y luego, cuando evolucionó el primer cordado de aguas poco profundas, estos genes se reconfiguraron como fotorreceptores y, utilizando el antiguo gen organizador de los ojos, evolucionaron hasta convertirse en un tipo de cámara. ojo. Para empezar, podría haber sido similar al hagfish, que se alimenta cerca del fondo y tiene ojos rudimentarios. También se podría esperar que los ojos que evolucionaron en la oscuridad tuvieran una capa reflectante detrás de la retina, como la tienen los animales nocturnos hoy en día, y por lo tanto, los fotorreceptores que están en la parte posterior de la retina para recibir la luz reflejada no fue un diseño tan pobre después de todo. La trayectoria total de la luz estaría menos obstruida por las células ganglionares si la luz atraviesa la capa ganglionar una vez, luego a los fotorreceptores, algunos pasan a la capa reflectante y luego, sin más interferencias, de regreso a los fotorreceptores. Los mamíferos probablemente evolucionaron en nichos nocturnos mientras que los dinosaurios dominaban el día. ¿Podrían haber evolucionado los mamíferos sin el diseño posterior de la retina? Los fotorreceptores dentro de la capa de ganglio recibirían luz reflejada después de pasar dos veces a través de la capa de ganglio y, por lo tanto, serían menos efectivos.

Se han realizado muchas investigaciones para satisfacer la ansiedad de Darwin sobre la complejidad del ojo. La evidencia de especies existentes y extintas da una serie plausible de pasos para la evolución del tipo de cámara y ojos compuestos. ¿Los ojos demuestran una evolución gradual? Uno todavía tiene que preguntarse por qué incluso los primeros animales tenían genes capaces de formar ojos y por qué el erizo de mar con discapacidad visual está cargado con cientos de genes homólogos a los expresados ​​en ojos de vertebrados. Esta paradoja ha surgido como un tema importante en el campo del desarrollo evolutivo (Yoon 2007), por lo que las nuevas formas complejas no requieren muchas mutaciones nuevas o muchos genes nuevos, sino pequeños cambios en los genes existentes y los planes de desarrollo, una especie de "herramienta equipo." Es posible que los principales acontecimientos de la evolución no dependan de nuevos genes o de la aparición de nuevas partes del cuerpo, sino de la situación ecológica adecuada para permitir una nueva expresión de genes ya presentes. Conway Morris (2003b, p. 166) llama a esto inherencia, por lo que los mismos bloques de construcción básicos de estructuras complejas están disponibles antes de ser reclutados para tareas nuevas y más sofisticadas, de modo que "el surgimiento se basa más en la cooptación y el redespliegue que en la invención". Entonces, ¿los "ojos" lo tienen sobre la cuestión de la evolución? Seguramente en el nivel anatómico, Darwin ha sido reivindicado, pero en el nivel celular quedan muchas preguntas y se puede esperar que los defensores del Diseño Inteligente todavía digan que no.

Quizás el animal ancestral tenía miles de genes, todos existiendo en un delicado equilibrio y con un inmenso potencial. En un linaje hijo, la duplicación y selección de genes lograron un nuevo equilibrio para desarrollar un órgano complejo como un ojo a partir de ese potencial inherente. En otro linaje de hijas, algún otro conjunto de circunstancias en un momento diferente o varias veces, también permitió que ese potencial se expresara como ojos. Pero quizás ese delicado equilibrio en el animal ancestral que se logró tan temprano en la historia de la vida, pero tan improbablemente debido a pasos graduales, y que es poco probable que haya recibido su inmenso potencial por casualidad, fue un regalo del Creador de información que estaba presente antes de la muerte. creación del universo.

Arendt, D., K. Tessmar-Raible, H. Snyman, A. Dorresteijn y J. Wittbrodt. 2004. Fotorreceptores ciliares con opsina de tipo vertebrado en un cerebro de invertebrados. Ciencia (5697): 869-871. http://search.epnet.com/.

Belie, M. 1996. Caja negra de Darwin: El desafío bioquímico a la evolución. The Free Press, Nueva York. 319 páginas.

Bellingham, J., S. Chaurasia, Z. Melyan, C. Liu, M. Cameron, E. Tarttelin, P. Iuvone, M. Hankins, G. Tosini y R. Lucas. 2006. Evolución de los fotorreceptores de melanopsina: descubrimiento y caracterización de una nueva melanopsina en vertebrados no mamíferos. PLOSBiología 4 (8): e254. http://www.plosbiology.org/.

Brodbeck, S. y C. Englert. 2004. Determinación genética de la nefrogénesis: la red de genes Pax / Eya / Six. PediatrNephrol19: 249-255. http://search.epnet.com/.

Conway Morris, S. 2003a. El primer día, Dios dijo. (Revisión de En un abrir y cerrar de ojos por Andrew Parker). American Scientist (julio-agosto): 365-367.

Conway Morris, S. 2003b. La solución de la vida: humanos inevitables en un universo solitario. Prensa de la Universidad de Cambridge. Cambridge. 485 páginas.

Fernald, R. 2006. Proyectando una luz genética sobre la evolución de los ojos. Science 313 (5795): 1914-1918. http://search.epnet.com/.

Gehring, W. 2005. Nuevas perspectivas sobre el desarrollo ocular y la evolución de los ojos y los fotorreceptores. Revista de herencia 96 (3): 171-184. http://proquest.umi.com/pdgweb/.

Kozmik, Z., N. Holland, J. Kreslova, D. Oliveri, M. Schubert, K. Jonasova, L. Holland, M. Pestarino, V. Benes y S. Candiani. 2007. Red Pax-Six-Eya-Dach durante el desarrollo del anfioxo: conservación in vitro pero especificidad de contexto in vivo (resumen del autor). Biología del desarrollo 306 (1): 143-160. http://www.galegroup.com/.

Nilsson, D-E., L. Gislen, M. Coates, C. Skogh y A. Garm. 2005. Óptica avanzada en un ojo de medusa. Nature 435: 201-205. http://search.epnet.com/.

Oakley, T. y C. Cunningham. 2002. Evidencia filogenética molecular del origen evolutivo independiente de un ojo compuesto de artrópodos. Proc Natl Acad Sci USA 99 (3): 1426-1430. http://www.jstor.org/.

Okano, T., D. Kojima, Y. Fukada, Y. Shichida y T. Yoshizawa. 1992. Estructuras primarias de pigmentos visuales de conos de pollo: las rodopsinas de vertebrados han evolucionado a partir de pigmentos visuales de conos. Proc Natl Acad Sci USA 89: 5932-5936. http://www.jstor.org/.

Parker, A. 2003. En un abrir y cerrar de ojos. Perseus Publishing, Cambridge, MA. 344 páginas. Consorcio de secuenciación del genoma del erizo de mar. 2006. El genoma del erizo de mar Strongylocentrotus purpuratus. Science 314: 941-951.


Conclusión

A pesar del gran interés en la señalización GPCR, su evolución sigue siendo enigmática. Existe alguna evidencia de que los 7TMR arqueales y bacterianos son homólogos a los 7TM / GPCR eucariotas [7]. Sin embargo, las proteínas G heterotriméricas / subunidades G alfa solo están presentes en eucariotas. Esto sugiere que los 7TM / GPCR ancestrales se señalan mediante mecanismos distintos al acoplamiento de la proteína G. Encontramos que el clan arrestina está presente en arqueas y bacterias, lo que plantea la posibilidad de que Spo0M pueda ser un socio de señalización primordial de 7TMR. Además, nuestros hallazgos de las opsinas cnidarios nos llevan a proponer que la subfamilia ciliar es ancestral de todas las opsinas bilaterales (ver también [34, 35]). Eso es consistente con la teoría de Darwin de que los ojos evolucionaron una vez.

Había dos familias principales de genes similares a la arrestina en los primeros eucariotas, la arrestina y la Vps26. Ambas familias de proteínas están bien caracterizadas y apuntan a la endocitosis / dinámica endosómica como funciones ancestrales de la arrestina / Vps26. La duplicación del dominio arrestina fue un evento crítico en la creación de la arrestina ancestral / Vps26. Esto podría haber creado mecanismos autoinhibidores (como los que se observan en las arrestinas beta), un tema recurrente en la evolución de la transducción de señales. Las similitudes funcionales de las beta arrestinas y las proteínas Vps26 nos llevan a especular que la arrestina / Vps26 original estaba involucrada en la internalización del receptor. Esto podría haber tenido dos clases de efectos del receptor en concierto: 1) desensibilización y reciclaje / degradación, y 2) señalización. Otros han planteado la hipótesis de que el papel original de las arrestinas puede haber sido el de adaptadores de señalización más que de terminadores [67]. Más arriba mencionamos la evidencia bioquímica de que la Vps26 de mamíferos y las arrestinas podrían tener funciones superpuestas [47, 48].

La homología de las arrestinas alfa y beta sugiere que sus funciones moleculares pueden ser similares. Hay pruebas de hongos de que la alfa arrestina PalF se une específicamente a un 7TMR activado [28]. Esa interacción tiene un papel de señalización positiva que aún no se ha identificado. También existen diferencias entre las clases alfa y beta. Las beta arrestinas son generalmente citoplásmicas en células no estimuladas, mientras que las alfa arrestinas se asocian a menudo con membranas [32, 68]. Solo los visuales / betas tienen la hélice I en el dominio N. Y las colas de las betas contienen motivos que interactúan con la clatrina, mientras que las de las alfas tienen motivos PY. Los estudios en levadura mostraron que los motivos de alfa arrestina PY interactúan con los dominios WW de la ubiquitina ligasa Rsp5p de HECT E3. Creemos que un papel importante de los alfa es reclutar proteínas WW para los receptores activados. Las arrestinas alfa y beta se coexpresan ampliamente. El hecho de que las arrestinas visuales / beta puedan heteroasociarse [69], sugiere que las alfa y las beta también pueden hacerlo. Dada la participación casi ubicua de las arrestinas beta en la señalización de 7TMR, especulamos que las alfa y las beta pueden funcionar de manera coordinada.


Introducción

Las rodopsinas microbianas son proteínas de membrana fotorreceptivas ampliamente distribuidas en bacterias, arqueas, eucariotas unicelulares y virus gigantes 1,2. Consisten en siete hélices α transmembrana (TM), con un cromóforo retiniano unido a un residuo de lisina conservado en la séptima hélice (Fig. 1a). La primera rodopsina microbiana, bacteriorrodopsina (BR), fue descubierta en la membrana plasmática de las arqueas halófilas. Halobacterium salinarum (anteriormente llamado H. halobio) 3. BR forma un parche de color púrpura en la membrana plasmática llamado membrana púrpura, que transporta H + hacia afuera utilizando la energía de la luz solar 4. Después del descubrimiento de BR, se informaron varios tipos de rodopsinas microbianas de diversos microorganismos, y los avances recientes en las técnicas de secuenciación del genoma han descubierto varios miles de genes de rodopsina microbiana 1,5,6,7. Estas rodopsinas microbianas muestran varios tipos de funciones biológicas tras la absorción de luz, lo que lleva atrans-hasta-13-cis isomerización retiniana. Entre ellos, los transportadores de iones, incluidas las bombas de iones accionadas por luz y los canales de iones activados por luz, son los más ubicuos (Fig. 1b). Las rodopsinas transportadoras de iones pueden transportar varios tipos de cationes y aniones, incluidos H +, Na +, K +, haluros (Cl -, Br -, I -), NO3 - , y entonces4 2, 8, 9, 10. Los mecanismos moleculares de las rodopsinas transportadoras de iones se han detallado en numerosos estudios biofísicos, estructurales y teóricos 1,2.

a Estructura esquemática de rodopsinas microbianas. B Árbol filogénico de rodopsinas microbianas. Las subfamilias de rodopsinas de bomba de iones impulsadas por luz a las que se apunta en este estudio son las rodopsinas microbianas sin bomba de iones de diferentes colores y las rodopsinas microbianas de bombeo de iones de orígenes virales eucariotas y gigantes se muestran en gris.

En los últimos años, muchas rodopsinas transportadoras de iones se han utilizado como herramientas moleculares en optogenética para controlar la actividad de neuronas animales ópticamente in vivo mediante expresión heteróloga 11, y la optogenética ha revelado varios conocimientos nuevos sobre la red neuronal relevante para la memoria, el movimiento y comportamiento emocional 12,13,14,15. Sin embargo, la fuerte dispersión de la luz por los tejidos biológicos y la toxicidad celular de la luz de longitud de onda más corta dificultan el control óptico preciso. Para sortear esta dificultad, se necesitan urgentemente nuevas herramientas de optogenética molecular basadas en rodopsinas desplazadas al rojo, que pueden controlarse mediante una dispersión débil y una luz de longitud de onda más larga de baja toxicidad. Por lo tanto, se han informado muchos enfoques para obtener rodopsinas desplazadas al rojo, incluido el cribado de genes, la mutación de aminoácidos basada en conocimientos biofísicos y estructurales y la introducción de análogos retinianos 16,17,18. Los conocimientos obtenidos en estos estudios experimentales y otros estudios teóricos y computacionales 19,20,21,22 revelaron el principio físico básico que regula las longitudes de onda máximas de absorción (λmax) de rodopsinas (también llamada regla espectral o de ajuste de color) en la que la distorsión de la cadena de polieno de la retina inducida por interacciones estéricas con los residuos circundantes, la interacción electrostática entre la base de Schiff protonada de la retina y los contraiones, y la polarización de la bolsa de unión retiniana juegan papel esencial 23. los λmax de varias rodopsinas podrían desplazarse al rojo entre 20 y 40 nm sin afectar la función de transporte de iones según estos conocimientos fisicoquímicos 17, 24, 25. Estos son ejemplos exitosos de enfoque experimental impulsado por el conocimiento. Recientemente, se informó sobre un nuevo método que utiliza un vector de rodopsina quimérico y un ensayo funcional para cribar el λmax y actividades de transporte de protones de varias rodopsinas microbianas que están presentes en entornos específicos 26. Este método identificó secuencias parciales de proteorrodopsina (PR) que absorbe el amarillo (560–570 nm), la subfamilia de rodopsina bacteriana que bombea H + hacia el exterior más abundante, del medio marino. Estos trabajos identificaron varias rodopsinas desplazadas al rojo 15,16,18,27. Especialmente, las herramientas optogenéticas más exitosas son las rodopsinas de canal desplazado al rojo, como Chrimson 27,28 y RubyACR 29, que pueden inducir e inhibir el disparo neural al absorber luz de 590 y 610 nm, respectivamente. La mutación racional de aminoácidos basada en la percepción estructural desplazó aún más al rojo la λmax de Chrimson a 608 nm 27. Se espera que el desarrollo de la tecnología de secuenciación de próxima generación continúe identificando más rápidamente una gran cantidad de nuevos genes de rodopsina, incluidas proteínas con una absorción de longitud de onda desplazada aún más larga. Sin embargo, el cribado de todos ellos mediante métodos experimentales o teóricos resultaría muy costoso. Por lo tanto, se necesita un enfoque menos costoso y más eficiente para detectar las rodopsinas desplazadas al rojo, y se espera que el estudio basado en datos sea la tercera clase de enfoque para investigar la regla de ajuste de color de las rodopsinas a bajo costo.

Para estimar el λmax de rodopsinas, recientemente introdujimos un enfoque basado en datos 30. En este estudio anterior, investigamos la relación estadística entre los tipos de aminoácidos en cada posición de las siete hélices TM y la longitud de onda de absorción de las rodopsinas. Construimos una base de datos que contiene 796 rodopsinas de tipo salvaje (WT) y sus variantes, el λmax de los cuales se había informado en estudios anteriores. Luego, evaluamos la fuerza de la relación con un enfoque de división de datos, es decir, el conjunto de datos se dividió en un conjunto de entrenamiento y un conjunto de prueba, el primero se usó para construir el modelo predictivo y el segundo para estimar el predictivo. capacidad.Los resultados de este estudio de "prueba de concepto" sugirieron que el λmax de una familia desconocida de rodopsinas podría predecirse con un error medio de ± 7,8 nm, que es comparable al error absoluto medio de λmax estimado por el método híbrido de mecánica cuántica / mecánica molecular (QM / MM) 21. Teniendo en cuenta el costo computacional de ambos enfoques, se encontró que el enfoque basado en datos es mucho más eficiente que el enfoque QM / MM, mientras que el último proporciona información sobre el origen físico que controla λmax.

Alentados por este resultado, en este estudio, presentamos un método de diseño experimental basado en aprendizaje automático (ML) que nos permite seleccionar de manera más eficiente a los candidatos de rodopsinas que probablemente tengan ganancias de desplazamiento al rojo con asistencia basada en datos en comparación con la selección aleatoria o basada en el conocimiento. Para este objetivo, construimos un nuevo conjunto de datos de 3022 rodopsinas de bomba de iones putativas de tipo salvaje que se obtuvieron de bases de datos públicas de genes (secuencias de proteínas no redundantes NCBI y proteínas metagenómicas 31 y el Tara Base de datos de microbiomas y viromas de los océanos 32) y para los cuales λmax aún no se han investigado experimentalmente para explorar nuevas rodopsinas desplazadas al rojo. El objetivo del presente estudio fue identificar rodopsinas con λmax más largo que las longitudes de onda de las rodopsinas representativas en cada subfamilia de rodopsinas microbianas para las cuales el λmax ya se ha informado (longitudes de onda base). Aquí, llamamos a los grados de desplazamiento al rojo de la longitud de onda desde la longitud de onda base la "ganancia de desplazamiento al rojo". Nos centramos en las rodopsinas con grandes ganancias de desplazamiento al rojo porque esto conduciría a la identificación de los tipos de aminoácidos y las posiciones de los residuos que desempeñan un papel importante en las longitudes de onda de absorción del desplazamiento al rojo. Además, es prácticamente importante en las aplicaciones optogenéticas tener una amplia variedad de rodopsinas de bombeo de iones de cada subfamilia para construir una nueva base para las cajas de herramientas de rodopsina con absorción desplazada al rojo y varios tipos de especies de iones que se pueden transportar. Construimos el método de diseño experimental basado en ML para que pudiera predecir adecuadamente las ganancias esperadas de desplazamiento al rojo, y aplicamos este nuevo método a 3022 rodopsinas putativas de bombeo de iones derivadas de orígenes arqueales y bacterianos que pueden expresarse fácilmente en Escherichia coli (Figura 1b).

Realizamos experimentos introduciendo los genes de rodopsina sintetizados en E. coli para medir las longitudes de onda de absorción de 65 candidatos para los cuales el método de diseño experimental basado en ML predijo que las ganancias esperadas eran & gt10 nm. De estos 65 candidatos seleccionados, 39 mostraron una coloración sustancial en E. coli celdas, 32 mostraron ganancias de desplazamiento al rojo reales, 6 mostraron cambios de azul y 1 no mostró ningún cambio, es decir, el 82% (= 32/39, 7.025 × 10 −5) de los candidatos seleccionados mostró ganancias de desplazamiento al rojo reales. Luego investigamos las propiedades de transporte de iones de las rodopsinas para las que las ganancias de desplazamiento al rojo eran & gt20 nm, y descubrimos que algunas en realidad tenían propiedades deseables de transporte de iones, lo que sugiere que ellas (y sus variantes) podrían potencialmente usarse como nuevas herramientas optogenéticas. . Además, las diferencias en las secuencias de aminoácidos de las rodopsinas recién examinadas y las representativas de la misma subfamilia podrían utilizarse para una investigación adicional de los mecanismos de desplazamiento al rojo. Este resultado sugiere que debería ser posible encontrar rodopsinas que tengan las propiedades deseadas sin realizar experimentos biológicos exhaustivos, y sugiere que los enfoques basados ​​en ML basados ​​en datos deberían desempeñar un papel eficaz en el diseño experimental de rodopsina y otros estudios fotobiológicos.


Abstracto

Se prepararon seis mutantes de rodopsina que contienen enlaces cruzados de disulfuro entre diferentes regiones citoplasmáticas: enlace disulfuro 1, entre Cys65 (bucle interhelical I-II) y Cys316 (final de la hélice VII) enlace disulfuro 2, entre Cys246 (final de la hélice VI) y Cys312 (final de la hélice VII) enlace disulfuro 3, entre Cys139 (final de la hélice III) y Cys248 (final de la hélice VI) enlace disulfuro 4, entre Cys139 (final de la hélice III) y Cys250 (final de la hélice VI) enlace disulfuro 5, entre Cys135 (final de la hélice III) y Cys250 (final de la hélice VI) y el enlace disulfuro 6, entre Cys245 (final de la hélice VI) y Cys338 (C-terminal). Los efectos de las restricciones locales causadas por los enlaces cruzados sobre la transducina (GT) Se estudiaron la activación y fosforilación por la rodopsina quinasa (RK) después de la iluminación. El enlace disulfuro 1 mostró poco efecto sobre GT activación o fosforilación por RK, lo que sugiere que el movimiento relativo entre el bucle interhelical I-II y la hélice VII no es crucial para el reconocimiento por GT o por RK. En contraste, los enlaces disulfuro 2-5 abolieron tanto GT activación y fosforilación por RK. El enlace disulfuro 6 resultó en un aumento de GT activación pero abolió la fosforilación por RK, lo que sugiere la estructura reconocida por GT se estabilizó en este mutante por reticulación del extremo C-terminal al extremo citoplásmico de la hélice VI. Por tanto, las consecuencias de los enlaces cruzados de disulfuro dependían de la ubicación de la restricción. En particular, los movimientos relativos de la hélice VI, con respecto a las hélices III y VII tras la activación de la luz, son necesarios para el reconocimiento de la rodopsina tanto por GT y RK. Además, los cambios conformacionales en la cara citoplásmica que son necesarios para las interacciones proteína-proteína no necesitan ser cooperativos y pueden ser segmentarios.

Este trabajo fue apoyado por NIH Grants GM28289 y NEI EY11716 (H.G.K.) y NIH Grant EY05216 y Jules Stein Professorship Endowment (W.L.H.). J.K.-S. es el recipiente de una beca predoctoral del Instituto Médico Howard Hughes. J H. ha recibido una beca posdoctoral para médicos del Instituto Médico Howard Hughes.

Este es el artículo 36 de la serie “Estructura y función de la rodopsina”. El artículo anterior es de Hwa et al. (1).


Ver el vídeo: Είναι Τα Αυγά Μια Υγιεινή Τροφή Τελικά ;;; (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Ceolbeorht

    Están equivocados. Intentemos discutir esto. Escríbeme en PM, habla.

  2. Khentimentiu

    Pregúntele a su calculadora

  3. Osker

    Se logra el mayor número de puntos. Creo que es una buena idea. Totalmente de acuerdo con ella.



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