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¿Por qué la mayoría de los fosfolípidos cargados negativamente se concentran en el folículo interno?

¿Por qué la mayoría de los fosfolípidos cargados negativamente se concentran en el folículo interno?


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Debido a la asimetría de la membrana lipídica, los fosfolípidos cargados negativamente como la fosfatidilserina, el fosfatidilinositol se concentran en la valva interna, creando una distribución de carga diferente entre las dos valvas.

¿Por qué la mayoría de los fosfolípidos cargados negativamente se concentran en el prospecto interior?


A7. Base molecular de interacciones de alta afinidad

  • Contribuido por Henry Jakubowski
  • Profesor (Química) en College of St. Benedict / St. Universidad de San Juan

¿Qué diferencia la unión de alta y baja afinidad a nivel molecular? ¿Las interacciones de alta afinidad tienen muchos enlaces H intramoleculares, puentes salinos, interacciones de van der Waals o son las interacciones hidrofóbicas las más importantes? Recientemente, se determinaron las estructuras cristalinas de una variedad de complejos anticuerpo-proteína con el fin de estudiar la base de la maduración por afinidad de las moléculas de anticuerpo. Es bien sabido que los anticuerpos provocados por la exposición a una molécula extraña (antígeno) son inicialmente de menor afinidad que los anticuerpos liberados más tarde en la respuesta inmune. Las células B productoras de anticuerpos pueden producir una cantidad increíble de anticuerpos diferentes debido a mecanismos genéticos (combinación de diferentes regiones variables de genes de anticuerpos mediante empalme, empalme impreciso e hipermutación de nucleótidos críticos en los genes de las regiones de unión a antígenos de los anticuerpos). Los clones de células productoras de anticuerpos con mayor afinidad se seleccionan mediante la unión y expansión clonal de estas células. Los investigadores estudiaron la estructura cristalina de 4 anticuerpos diferentes que se unían al mismo sitio (epítopo) en la proteína antígeno lisozima. El aumento de la afinidad se correlacionó con el aumento del área superficial apolar enterrada y no con el aumento del número de enlaces H o puentes salinos.

Li, Y. et al. Naturaleza: Biología estructural. 6, pág. 484 (2003)

Las interacciones electrostáticas entre moléculas biológicas siguen siendo interacciones muy importantes, aunque las consideremos inespecíficas. Sea testigo de la interacción de las proteínas de unión al ADN con los dominios positivos con el polianión negativo, el ADN. El encuentro inicial será de origen electrostático y obviamente importante para dirigir las proteínas al ADN, donde pueden tener lugar interacciones específicas adicionales.

En un ejemplo similar (Yeung, T et al.), Se informó recientemente que las proteínas con carga positiva moderada se dirigen a los endosomas y lisosomas a través de interacciones con fosfatidilserina (PS) de membrana con carga negativa, mientras que las proteínas con carga más positiva se dirigen a la superficie interna de la membrana plasmática, que está enriquecida en PS y derivados de fosfatidil inositol fosforilados (PIP2, PIP3), como se muestra a continuación.

Figura: fosfolípidos cargados negativamente en membranas biológicas

Para estudiar esto, utilizaron el dominio C2 de la lactadherina (Lact-C2) de la leche que se une al PS en presencia de calcio. El dominio C2 se unió covalentemente a la proteína verde fluorescente, una proteína que contiene un fluoróforo interno compuesto por tres aminoácidos (Ser65-Tyr66-Gly67) que se ciclan espontáneamente al plegarse para producir un fluoróforo que emite luz verde. Se introdujo un gen de fusión de Lact-C2 y GFP en levadura de tipo salvaje (WT) y mutante que carecía de PS. Se unió a la valva interna en las células WT y a las vesículas del endosoma y del lisosoma, pero se encontró difundido a través del citoplasma en las células mutantes. También fabricaron sondas catiónicas con colas de farnesilo unidas que podrían anclar las sondas solubles a las membranas. Las sondas con carga más positiva se reclutaron en la valva interna de la membrana plasmática, mientras que las menos cargadas se reclutaron en vesículas internas. Los autores especulan que el PS en las capas de la membrana citoplasmática puede dirigir las proteínas de transducción de señales a estas regiones.

Anticuerpos con afinidad infinita. Chmura y col. PNAS. 98, pág. 8480 (1998)


Nanotecnología farmacéutica: breve perspectiva sobre la administración de fármacos lipídicos y su escenario actual

Karthik Siram,. R. Hariprasad, en Aplicaciones biomédicas de nanopartículas, 2019

2.4 Fosfolípidos

Los fosfolípidos son una clase importante de lípidos de membrana que contienen dos categorías de lípidos, glicerofosfolípidos y esfingolípidos. Los glicerofosfolípidos son similares a los triglicéridos excepto que un grupo hidroxilo del glicerol se reemplaza por el éster de ácido fosfórico y un aminoalcohol, unidos a través de un enlace fosfodiéster. Forman una parte muy importante de las membranas celulares, lo que podría ser la posible razón del éxito de los liposomas (que están formados por fosfolípidos). Existen varios tipos de fosfolípidos en el cuerpo, incluido el cerebro. Las lecitinas son un tipo de fosfolípidos que el cuerpo puede sintetizar, se encuentran en las células del cuerpo y también participan en la digestión (Jannin et al., 2008 O'Driscoll y Griffin, 2008).

Los esfingolípidos (o lípidos cerebrales) son otro tipo de fosfolípidos que son ésteres de un alcohol de 18 carbonos llamado esfingosina. Son similares a los fosfolípidos, pero la columna vertebral de glicerol (en los fosfolípidos) se reemplaza por esfingosina. Son esenciales para la estructura de las membranas celulares y abundan en los tejidos del cerebro y las membranas de las células nerviosas. Los esfingolípidos incluyen las esfingomielinas y los cerebrósidos que se basan en la molécula esfingosina. Como sugiere su nombre, estos lípidos están afiliados a la vaina de mielina que rodea las células de las neuronas. Las esfingomielinas comprenden aproximadamente el 25% de los lípidos de la vaina de mielina y su función clave es la de transmitir señales eléctricas. Los cerebrósidos no son fosfolípidos, pero contienen esfingosina.


Introducción

Uno de los prerrequisitos fundamentales para la función de las células epiteliales es la polarización a lo largo de su eje apical-basal. Esta polaridad apical-basal está establecida y regulada por un conjunto de determinantes de polaridad altamente conservados (Tabla 1), que actúan de manera antagónica para mantener el equilibrio entre el dominio de la membrana plasmática apical y basolateral. En particular, la mayoría de los determinantes clave de esta polaridad epitelial apical-basal también regulan la polaridad anteroposterior en el cigoto de Caenorhabditis elegans y el ovocito de Drosophila así como la polaridad delantera-trasera en las células migratorias (para una revisión, véase St Johnston y Ahringer, 2010 Tepass, 2012 Rodríguez-Boulan y Macara, 2014 Campanale et al., 2017).

Tabla 1. Resumen de reguladores de polaridad conservados y su capacidad de unión a fosfolípidos informada.

Para lograr este equilibrio, los determinantes de polaridad se agrupan en complejos de polaridad apical y basolateral: en particular, el complejo PAR / aPKC y el complejo Crumbs determinan el dominio de la membrana plasmática apical, mientras que el Scribble (Scrb) / Discs Large (Dlg) / Letal (2) Complejo de larvas gigantes (Lgl) junto con las quinasas PAR-1 y LKB1 (PAR-4 en C. elegans) fundamentan el dominio (baso-) lateral (Figura 1). Los componentes centrales del complejo PAR / aPKC son las proteínas de andamiaje PAR-3 (Bazooka en Drosophila) y PAR-6 (PAR-6 & # x03B1 / & # x03B2 / & # x03B3 en mamíferos) y la serina / treonina quinasa aPKC (proteína quinasa C atípica, proteína quinasa C & # x03B6 y & # x03B9 en mamíferos). Además, PAR-6 está regulado por la pequeña GTPasa Cdc42, que también se asocia dinámicamente con el complejo PAR.

Figura 1. (A) Esquema simplificado de una célula epitelial diferenciada con reguladores de polaridad apical-basal y su interacción fosfolípida descrita. La polarización apical-basal comienza con el reclutamiento y activación de PI3-Quinasa a las adherencias focales (complejos integrina) y al complejo Dystroglicano, determinando el lado basal de la célula epitelial. Posteriormente, el complejo PAR / aPKC (PAR-3, PAR-6, aPKC) se localiza en las uniones estrechas (TJ) por PAR-3. PAR-3 también recluta PTEN, que cataliza el cambio de PI (3,4,5) P3 a PI (4,5) P2. Además, PAR-3 une el activador de Rac1 Tiam1 y el objetivo de PAR-6 / aPKC Cdc42 al complejo. Junto y parcialmente en redundancia con el segundo complejo asociado a TJ, el complejo Crb (Crb, Pals1 y PATJ), el complejo PAR / aPKC determina el dominio de la membrana plasmática apical enriquecido con PI (4,5) P2, que está compensado por los reguladores de polaridad de las células basolaterales. Aquí, el módulo Lgl / Dlg / Scrb y la quinasa LKB1 / PAR-1 también exhiben capacidades de unión a fosfolípidos, que son esenciales para su localización y función. (B) Complejos de polaridad y fosfolípidos que regulan la migración celular. En contraste con la polaridad apical-basal, las células migratorias exhiben una polaridad delantera-trasera con reguladores de polaridad apical y basolateral que se localizan en el borde delantero, regulando las protuberancias celulares (lamelipodios en particular vía Rac1 y filopodios vía Cdc42) modulando el citoesqueleto de actina (fibras grises ) o que afectan a los microtúbulos (fibras verdes).

Dentro del complejo Crumbs (Crb), la proteína transmembrana Crb se estabiliza en la membrana plasmática por su proteína adaptadora Pals1 (Stardust en Drosophila), que a su vez recluta las proteínas adaptadoras, la proteína de unión estrecha asociada a Pals1 (PATJ) y Lin-7 al complejo (revisado por Bulgakova y Knust, 2009). Sin embargo, varios estudios demostraron una diafonía entre estos dos complejos apicales, lo que indica que su composición es altamente dinámica y depende del tipo celular, estado de diferenciación y otros estímulos del epitelio (Hurd et al., 2003b Gao y Macara, 2004 Lemmers et al. ., 2004 Penkert et al., 2004 Sotillos et al., 2004 Wang et al., 2004 Kempkens et al., 2006 Krahn et al., 2010a Sen et al., 2015 Whitney et al., 2016). Las Scrb, Dlg y Lgl localizadas basolaterales son proteínas de andamiaje que funcionan como un módulo para determinar el dominio de la membrana plasmática basolateral y para regular el ensamblaje de los contactos celulares. En particular, la eliminación de estos componentes da como resultado no solo defectos de polaridad, sino también un crecimiento excesivo de tejido (en Drosophila y hasta cierto punto en vertebrados), lo que lleva a la identificación de estas proteínas como supresores de tumores (revisado por Stephens et al., 2018).

Para excluir mutuamente los determinantes apical y basolateral, aPKC fosforila Lgl y PAR-1, que posteriormente se disocian de la membrana plasmática en la zona apical de los epitelios apical activa aPKC y las células madre neurales polarizadas apical-basal (neuroblastos) de Drosophila (Betschinger et al., 2003 Plant et al., 2003 Hurov et al., 2004 Suzuki et al., 2004 Wirtz-Peitz et al., 2008 Doerflinger et al., 2010). Por el contrario, PAR-1 fosforila PAR-3 y aPKC, desplazándolos de la corteza basolateral (Benton y St Johnston, 2003 Hurd et al., 2003a Krahn et al., 2009). En Drosophila neuroblastos, aPKC también excluye la proteína adaptadora Miranda y el inhibidor Notch Numb de la corteza basal por fosforilación, controlando así la división celular asimétrica (Smith et al., 2007 Atwood y Prehoda, 2009).

Los fosfolípidos son un componente importante de las membranas biológicas y no solo son responsables de las fluctuaciones dinámicas de la membrana, sino que también funcionan como centros de señalización (para una revisión, ver Liu et al., 2013 Schink et al., 2016 Yang et al., 2018 Kay y Fairn, 2019) . La fosfatidilcolina (PC), la fosfatidiletanolamina (PE), la fosfatidilserina (PS) y la esfingomielina son las más frecuentes y constituyen el marco de las membranas biológicas, estabilizadas por el colesterol. Sin embargo, se ha descubierto que el ácido fosfatídico (PA) y los fosfoinosítidos (PI), menos abundantes, desempeñan papeles cruciales en el reclutamiento de proteínas asociadas a la membrana y funcionan como centros de señalización. Además, la acumulación de distintos fosfolípidos (en particular de la familia PI) es un rasgo característico de diferentes compartimentos celulares, dirigidos a proteínas de unión de fosfolípidos a estos compartimentos. En la Figura 2 se ofrece una descripción general de la generación y el metabolismo de los principales fosfolípidos discutidos en esta revisión.

Figura 2. Metabolismo de los principales fosfolípidos implicados en la polaridad celular. DGK, diacilglicerol quinasa. CDP-DG, citidina difosfato diacilglicerol. CDS, CDP-diacilglicerol sintasa. FIG4, FIG4 fosfoinositido 5-fosfatasa. Contiene dedos de zinc tipo FYVE. INPP4, inositol polifosfato-4-fosfatasa. OCRL, OCRL inositol polifosfato 5-fosfatasa. PIKfyve, fosfoinositido quinasa. PIS, PI sintasa. PTEN, homólogo de fosfatasa y tensina. SHIP, dominio de homología Src 2 (SH2) que contiene polifosfato de inositol 5-fosfatasa. TPTE, fosfatasa transmembrana con homología de tensina.


Aceites vegetales: composición y análisis

Fosfátidos

Los fosfátidos son diglicéridos que se han esterificado con un grupo fosfato en el snPosición -3 que a su vez puede esterificarse de nuevo con el grupo hidroxilo de compuestos indicados como X: colina, etanolamina o inositol. Los fosfátidos resultantes se denominan fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) y fosfatidilinositol (PI). La estructura en la que R1 y R2 representan cadenas de ácidos grasos se da en el texto siguiente:

Al grupo fosfato le queda un grupo hidroxilo libre que es bastante ácido (pKa & lt 3,5). En el petróleo crudo, puede tener un contraión metálico (potasio, calcio o magnesio) o hidrógeno. Este hidrógeno se titula cuando se mide la acidez del aceite. Cuando el grupo X es un átomo de hidrógeno, el fosfátido se llama ácido fosfatídico (PA). Se forma durante el secado, acondicionamiento y extracción de las semillas oleaginosas. Si el PA está presente en forma de ácido libre o sal de potasio, se eliminará del aceite mediante hidratación con desgomado con agua. Si el PA está presente como una sal de calcio o magnesio, esta sal permanecerá en el aceite en el desgomado del agua como un llamado fosfátido no hidratable.

Además de PC, PE, PI y PA, existen algunos fosfátidos menores, como la fosfatidilserina, en los que el grupo fosfato se ha esterificado con el aminoácido serina. Están los lisocompuestos en los que se ha eliminado uno de los restos de ácidos grasos. Existe la acetilfosfatidiletanolamina en la que se ha acetilado el grupo amino. Está el fosfatidilglicerol en el que el grupo fosfato se ha esterificado con un resto de glicerol.


Manipulación de la asimetría de la membrana

Se muestra que las membranas de las células vivas son intrínsecamente asimétricas. Los modelos de membrana utilizados para estudios in vitro han resultado difíciles de producir bicapas asimétricas como en las células vivas [16]. La metodología de bicapa lipídica admitida (SLB) fue uno de los primeros enfoques con el objetivo de manipular la asimetría de la membrana. SLB consiste en una bicapa lipídica extendida sobre un soporte físico (superficie), que puede ser un sólido, un polímero "amortiguación" o una monocapa autoensamblada [17]. Además, SLB se puede atar a la superficie, suspender libremente, o una bicapa lipídica con soporte sólido puede ser el soporte para las capas vesiculares (Figura ( PageIndex <9> )). Las vesículas se colocan inicialmente en la superficie y se rompen después de la deformación inducida por el soporte. Finalmente, las bicapas de las vesículas rotas se fusionan y forman el SLB (Figura ( PageIndex <1> ) 0). Los estudios con SLB permiten analizar la composición molecular, la distribución molecular y la curvatura de las membranas, que son los factores responsables de la asimetría de las membranas.

Figura ( PageIndex <9> ). Bicapas lipídicas admitidas: tipos básicos y figura ( PageIndex <1> ) 0. Formación de SLB (Tomado de: Richter et al, Langmuir, Vol. 22 No. 8, 2006).

Cuestiones como las interacciones no deseadas bicapa-soporte, y el hecho de que en algunos casos la bicapa soportada se vuelve completamente inmóvil, explican las dificultades para controlar la asimetría de la membrana [16]. Además, una parte sustancial de la investigación con SLB ha utilizado vesículas con composiciones simétricas en ambos folletos [18]. Hay nuevos enfoques en curso en los últimos años con el objetivo de manipular específicamente la asimetría de la membrana. Estas metodologías incluyen bicapas de interfaz de gota, técnicas de emulsión invertida, así como intercambio catalizado por metil-beta-ciclodextrina. El último enfoque consiste básicamente en transportar fosfolípidos desde la valva exterior de los liposomas de un donante hasta la valva exterior de un liposoma aceptor [19]. Este método es capaz de producir liposomas asimétricos en una amplia gama de diámetros y se considera un método fácil de transferir fosfolípidos aniónicos como el PS a una valva externa de una bicapa lipídica, asemejándose así a la asimetría de las membranas biológicas. En los últimos años, ha sido posible realizar estudios cuantitativos en tasas de flip / flop de lípidos, dando nuevas posibilidades para el análisis de la composición molecular y distribución de membranas biológicas [18].


Función

Los fosfolípidos son moléculas muy importantes ya que son un componente vital de las membranas celulares. Ayudan a que las membranas celulares y las membranas que rodean a los orgánulos sean flexibles y no rígidas. Esta fluidez permite la formación de vesículas, lo que permite que las sustancias entren o salgan de una célula a través de endocitosis y exocitosis. Los fosfolípidos también actúan como sitios de unión para proteínas que se unen a la membrana celular. Los fosfolípidos son componentes importantes de tejidos y órganos, incluidos el cerebro y el corazón. Son necesarios para el buen funcionamiento del sistema nervioso, digestivo y cardiovascular. Los fosfolípidos se utilizan en las comunicaciones de célula a célula, ya que están involucrados en mecanismos de señal que desencadenan acciones como la coagulación sanguínea y la apoptosis.


Estructura de una molécula de fosfolípidos

Un fosfolípido es una molécula anfipática, lo que significa que tiene un componente hidrófobo e hidrófilo. Una sola molécula de fosfolípido tiene un grupo fosfato en un extremo, llamado & # 8220head, & # 8221 y dos cadenas de ácidos grasos una al lado de la otra que forman los lípidos & # 8220 colas. & # 8221 El grupo fosfato está cargado negativamente, lo que hace que la cabeza sea polar e hidrófila, o & # 8220 amante del agua & # 8221 Las cabezas de fosfato son atraídas por las moléculas de agua en su entorno.

Las colas de lípidos, por otro lado, no están cargadas, son apolares e hidrófobas, o & # 8220 temen al agua & # 8221. Una molécula hidrófoba se repele y es repelida por el agua. Algunas colas de lípidos consisten en ácidos grasos saturados y algunas contienen ácidos grasos insaturados. Esta combinación se suma a la fluidez de las colas que están en constante movimiento.


Tratamiento de la infección en quemaduras.

James J. Gallagher,. David N. Herndon, en Total Burn Care (tercera edición), 2007

Polimixinas

Las polimixinas son moléculas anfipáticas que interactúan con el lipopolisacárido (LPS) en la membrana externa bacteriana. La entrada en la célula no es necesaria, ya que la polimixina B unida covalentemente a perlas de agarosa retiene la capacidad de alterar la permeabilidad de la membrana e inhibir la respiración bacteriana. La unión inicial a la membrana externa tiene lugar cuando la porción policatiónica de la polimixina B desplaza los puentes de Ca ++ y Mg ++ que normalmente estabilizan las moléculas de LPS en la valva externa de la membrana externa bacteriana. 77 La unión puede ser antagonizada por altas concentraciones de cationes divalentes. La formación de complejos adicional con LPS se ve facilitada por la interacción hidrófoba entre la porción de lípido A de LPS y el ácido graso del antibiótico. La inserción del antibiótico en la membrana externa rompe la membrana y libera LPS en el medio circundante. También tienen potentes propiedades antiendotóxicas y actividad antibacteriana contra P. aeruginosa y muchas de las enterobacterias.

Según Storm et al., Las polimixinas son bacteriostáticas a bajas concentraciones y bactericidas a altas concentraciones. Nord y Hoeprich informaron que a una concentración de 0.01 m mol / mL, el sulfato de polimixina B era bactericida al 88% de la P. aeruginosa cepas probadas. 77 Actividad bactericida contra P. aeruginosa no se ve con colistina hasta que su concentración alcanza 0.1 μ mol / mL. 77 La polimixina B y la colistina (polimixina E) generalmente se administran en dosis de 1,5 a 2,5 y 5 mg / kg / día, respectivamente, en dos dosis divididas. La dosificación debe modificarse en caso de insuficiencia renal, ya que el riñón es la principal vía de eliminación. La distribución en el líquido pleural, las articulaciones y el líquido cefalorraquídeo es deficiente.

Las polimixinas se recomiendan para infecciones sistémicas graves causadas por bacterias gramnegativas que son resistentes a otros agentes y tienen un papel definido en la terapia de infecciones bacterianas gramnegativas multirresistentes. El hospital de quemados pediátricos, Shriners Burns Hospital en Galveston, Texas, revisó el uso de colistimetato de sodio entre 2000 y 2004 en 109 pacientes, 72 hombres y 37 mujeres (mediana y edad promedio de 9 años) con un TBSA del 21% al 99% ( mediana 60% y media 62%). La tasa de supervivencia global fue del 80% en los 109 pacientes. El colistimetato de sodio proporcionó una importante opción de rescate para los pacientes quemados con infecciones gramnegativas potencialmente mortales y tratadas de otra manera de manera incompleta. En 2005 en SBH-G, A. baumannii / haemolyticus, E. cloacae, E. coli, y K. pneumoniae todos mostraron 100% de susceptibilidad a la colistina y polimixina B mientras que P. aeruginosa mostraron 96% y 99% de susceptibilidad a colistina y polimixina B, respectivamente.

Sin embargo, es necesario monitorear la nefrotoxicidad dependiente de la dosis y la toxicidad del SNC asociada con su uso sistémico para lograr un resultado terapéutico. Cuando se administra polimixina B a animales o seres humanos, se une, a través de sus grupos de aminoácidos libres, a fosfolípidos cargados negativamente en los tejidos. Kunin y Bugg demostraron que la unión es mayor a los tejidos del riñón y el cerebro, seguida por los tejidos del hígado, los músculos y los pulmones. 77 Después de dosis repetidas, el fármaco se acumula en los tejidos a concentraciones de cuatro a cinco veces más altas que las concentraciones séricas máximas y persiste en los tejidos durante al menos 5-7 días. 77 La eliminación del fármaco mediante diálisis puede resultar difícil debido a la gran unión tisular. En nuestro estudio, el colistimetato de sodio parece aumentar proporcionalmente la incidencia de C. difficile-colitis, disfunción renal y neuropatías asociadas en relación con la duración de su uso.


Métodos

Lípidos y péptidos / proteínas

LPS mutante áspero de Salmonella enterica serovar MinnesotaS. minnesota) cepas R595 (LPS R595), R4 (LPS R4), R7 (LPS R7), Rz (LPS Rz), R5 (LPS R5), R345 (LPS R345) y R60 (LPS R60), así como mutante rugoso profundo LPS de Escherichia coli cepa F515 (LPS F515) y Proteus mirabilis se utilizó la cepa R45 (LPS R45) [45-50]. El LPS se extrajo mediante el método de fenol / cloroformo / éter de petróleo [51], se purificó, se liofilizó y se transformó en la forma de sal de trietilamina. Las estructuras químicas se dan en la Fig. 1. Las cantidades de sustituciones no estequiométricas por ácidos grasos (datos no mostrados), Ara4N, fosfatos adicionales y fosfoetanolamina se analizaron mediante espectrometría de masas. En LPS R595, el Ara4N unido al 4'-fosfato estaba presente a un nivel del 40%. En LPS R45, aproximadamente el 50% del 4'-fosfato del lípido A y el 50% del primer Kdo fueron sustituidos por Ara4N. Teniendo en cuenta las cantidades de grupos fosfato cargados negativamente y Kdo y los Ara4N cargados positivamente, las cargas netas de los LPS resumidas en la Tab. 1, fueron calculados.

Se adquirieron fosfatidilcolina (PC) de lecitina de yema de huevo, fosfatidilglicerol (PG) de lecitina de yema de huevo (sal sódica) y difosfatidilglicerol sintético (DPG) de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EE. UU.) Y se utilizaron sin purificación adicional.

La polimixina B (PMB) y su nonapéptido (PMBN), lactoferrina de la leche humana, lactoalbúmina de la leche bovina, lisozima de la clara de huevo de gallina y hemoglobina humana se adquirieron de Sigma Aldrich (Deisenhofen, Alemania), y albúmina sérica humana recombinante (rHSA) de Welfide Corporation (Osaka, Japón). BPI recombinante1–193 (rBPI21) fue un amable regalo de XOMA (Berkeley, CA, EE. UU.). El conejo CAP18106–137 fue un amable obsequio de J.W. Larrick (Palo Alto Institute of Molecular Medicine, Mountain View, CA, EE. UU.).

Determinación del potencial superficial

Las cargas fijas dentro de los grupos de cabeza de las moléculas de lípidos provocan un potencial eléctrico en la superficie de la bicapa lipídica con respecto a la solución de baño circundante, el potencial de superficie [27, 52]. El potencial ζ está relacionado con el potencial de superficie de los agregados lipídicos y se puede calcular a partir de la movilidad electroforética de los agregados según la aproximación de Smoluchowski [53]:

donde ζ es el ζ-Potencial, μ la movilidad electroforética, η la viscosidad (0,89 · 10-3 kg m -1 s -1), ε0 la constante dieléctrica de vacío (8.854 · 10-12 A 2 s 4 kg -1 m -3) y εr la permitividad dieléctrica del agua (78.54).

Para estudiar el potencial de superficie de los agregados de fosfolípidos y LPS, determinamos sus potenciales ζ. Las medidas se realizaron en un ZetaSizer4 (Malvern Instruments GmbH, Herrsching, Alemania) a 25 ° C y con un campo eléctrico impulsor de 19,2 V cm -1.

Los agregados se prepararon como dispersiones acuosas 1 mM de lípidos en tampón (Tris 10 mM, CsCl 2 mM2, pH 7). Brevemente, las dispersiones de lípidos se sonicaron durante 20 min a 60 ° C, se enfriaron a 4 ° C durante 30 min y se sometieron a ciclos de temperatura dos veces entre 60 ° C y 4 ° C (30 min cada una). Las dispersiones se equilibraron durante la noche a 4 ° C. Antes de las mediciones del potencial ζ, las dispersiones de lípidos se diluyeron hasta una concentración final de 0,01 mM. Los valores presentados (Fig. 3) son valores medios con derivaciones estándar resultantes de 3 a 5 experimentos independientes.

Preparación de monocapas de lípidos utilizadas en experimentos de balance de películas.

En general, se utilizaron dos tipos de experimentos de balance de película de Langmuir-Pockels: (i) en una constante y (ii) en un área de película variable. En ambos tipos de experimentos, los fosfolípidos se disolvieron en cloroformo y los LPS en una mezcla 10: 1 (v: v) de cloroformo y metanol a una concentración de 1 mM. Todos los lípidos se depositaron en las cantidades dadas en la subfase y se dejó que los disolventes se evaporaran durante 5 min.

Determinación de la adsorción y el desplazamiento de calcio a partir de monocapas de lípidos.

La adsorción de calcio a monocapas de lípidos preparadas a partir de fosfolípidos o LPS se determinó depositando 10 nmol del lípido respectivo en 60 ml de una subfase acuosa tamponada con HEPES 5 mM y ajustada a pH 7. Después del equilibrio de la monocapa, se añadieron a la subfase 5 alícuotas de 200 μl de una solución de calcio 1,5 mM ajustada a una actividad β relativa de 24 kBq / ml con 45 Ca 2+ radiactivo (Amersham Buchler, Braunschweig, Alemania), lo que resultó en una concentración final de calcio de 25 µM. Los iones de calcio se unen a los grupos de cabeza cargados negativamente de los lípidos, y la radiación β de baja energía que se origina en el 45 Ca 2+ unido ya no es absorbida por la capa de hidratación y, por lo tanto, se observó un aumento en la intensidad β utilizando un Contador β (detector de ionización de gas LB124, Berthold, Wildbad, Alemania) (Fig 2, paso 1 y amp 2). Por tanto, este método permite determinar la cantidad relativa de calcio unido a la monocapa [24]. Para mantener el número de moléculas de lípidos y, por lo tanto, el número potencial de sitios de unión para el calcio por debajo del área de detección del contador β constante, los experimentos se realizaron en una cubeta de vidrio acrílico con un área de película constante total de 112 cm 2.

La intensidad β I mononucleosis infecciosaprocedente de 45 Ca 2+ unido a la monocapa de lípidos a una concentración dada de Ca 2+ se calculó de acuerdo con la ecuación:

(Ecuación 5) I mononucleosis infecciosa= I nene- I sub,

dónde I nenees la intensidad β que se origina en la monocapa y la subfase y I subes la intensidad β de la subfase pura. Estos y los siguientes experimentos se realizaron a una temperatura de subfase de 20 ° C en lugar de 37 ° C para evitar la condensación en el contador β.

Para investigar la capacidad de varios péptidos / proteínas para desplazar iones de Ca 2+ divalentes de las monocapas de LPS F515, una subfase que contiene 12,5 μM de Ca 2+ dopado con 45 Ca 2+ radiactivo (que da como resultado una actividad β relativa de 250 Bq / ml) , tamponado con HEPES 5 mM a pH 7. También en los experimentos de desplazamiento, el número de moléculas de LPS se mantuvo constante. Los agentes se agregaron a la subfase con un área de película total constante y una presión lateral relativamente baja de la monocapa (

10 mN m -1). De esta manera, la presión final después de la saturación de la intercalación de agentes todavía estaba en el rango de presiones laterales en las membranas biológicas [41, 42]. Los péptidos / proteínas se añadieron a la subfase en diferentes concentraciones y se registraron las tasas de recuento de beta de equilibrio (Fig. 2, paso 3). El relativo I rel(C) en dependencia de la concentración de péptido / proteína C fue calculado a partir de

dónde I nene(C) es la intensidad β absoluta, I subla intensidad β que se origina en la subfase pura, y I mononucleosis infecciosala intensidad β procedente de la monocapa. A partir de las curvas de desplazamiento, las concentraciones a las que se desplazó el 50% del calcio (IC50 valor) por los péptidos / proteínas se determinaron y resumieron en la Tab. 1.

Todos los valores presentados son valores medios con derivaciones estándar resultantes de 3 a 4 experimentos independientes.

Influencia de la presión lateral sobre la adsorción de calcio a monocapas de LPS

Se utilizó una balanza de película de Langmuir-Pockels equipada con un sistema Wilhelmy (Munitech, München, Alemania) para determinar las isotermas de presión de lípidos / área de las monocapas de LPS F515. Se determinaron la presión lateral, el área y la intensidad β. Para los experimentos, se esparcieron 36 μl de LPS F515 sobre las superficies del tampón de 290 cm 2. Se dejó evaporar el disolvente a presión cero durante 5 min. Luego, las monocapas se comprimieron isotérmicamente a una velocidad de 1,5 mm 2 s -1 a una presión lateral de 40 mN m -1.


Ver el vídeo: Positive and Negative Charges. Science. iKen (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Aghy

    Bien hecho, esta muy buena oración es muy correcta

  2. Abbudin

    Mejor tarde que nunca.

  3. Goveniayle

    Debemos ser optimistas.

  4. Tohias

    Lo siento, esto no absolutamente que es necesario para mí.

  5. Mahkah

    Confirmo. Fue y conmigo.

  6. Amet

    ¡Aquí hay un volante!



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