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Representación correcta / completa de las estadísticas de RTPCR

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En los artículos que informan sobre una cuantificación relativa de la expresión génica mediante RTPCR, a menudo veo un gráfico de barras con media ± error estándar o desviación, con la desviación perteneciente a réplicas biológicas. Esto ignora todas las capas anteriores de réplicas técnicas. En la estimación regular $ 2 ^ { Delta ( Delta Ct)} $ con 3 reacciones por cebador / plantilla, tenemos la desviación estándar (SD) de cada réplica técnica, luego la SD de la normalización, y finalmente la SD de la cuantificación. Si los resultados finales son cambios de pliegue, agregue una capa más a esto. Ni siquiera incluyo la normalización con la media geométrica de 3 genes de mantenimiento (el mejor método). ¿Cómo puedo calcular / representar correctamente las variaciones estadísticas en este caso?


Creo que puedes seguir este método:

  1. Pruebe la significancia estadística de un solo experimento comparando réplicas técnicas (digamos Pruebas: T1, T2, T3 y controles: C1, C2, C3). Esto le dirá si el instrumento puede detectar diferencias de manera confiable o no. Tenga en cuenta que debe comparar la expresión relativa (es decir, con su gen de referencia) y no los valores de CT. El método ΔΔCt está bien, pero debe tener en cuenta que no es necesariamente una potencia de 2; 2 denota una perfecta eficacia de la PCR. Vea estas publicaciones:
  2. Si la diferencia se encuentra significativa en todas las réplicas técnicas, pruebe la diferencia entre las réplicas biológicas utilizando los medios de las réplicas técnicas en cada experimento; por ejemplo media de T1, T2 y T3 en replicación biológicaa ($ bar {T_a} $) utilizado como valor de muestra para esa réplica. Puede continuar con la prueba t para calcular la significancia estadística que le dirá si la diferencia en la expresión se debe a un comportamiento celular aleatorio o no. También puede hacer un ANOVA para comparar la varianza entre réplicas técnicas (dentro de un experimento) y réplicas biológicas (media de las réplicas técnicas entre experimentos). ANOVA le permite conocer algunos aspectos de la reproducibilidad de una técnica de medición.
  3. Los cambios de pliegue (FC) son un tema problemático porque muchos biólogos parecen equivocarse con la interpretación de los datos. En primer lugar, no se puede aplicar una prueba t a FC directamente (especialmente si FC se calcula por pares para cada réplica). Ahora todo lo que tiene es una sola variable aleatoria, es decir, el cambio de pliegue que no puede comparar estadísticamente con nada. Los cambios de pliegue no son realmente malos, pero recomendaría que se realice una prueba t entre el control y las muestras de prueba y, si la diferencia se encuentra estadísticamente relevante, informe el FC. Personalmente conozco a muchas personas que hacen lo contrario y establecen la varianza de la muestra de control como cero (porque el FC por pares sería = 1 en todos los casos): esto es un error.


Ver el vídeo: Análisis de datos de RT-qPCR Video 14. Exportacion y calculos con LinReg PCR (Agosto 2022).