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Unión de una macromolécula M con una pequeña molécula L - Biología

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Unión de una macromolécula M con una pequeña molécula L

GSK4112, una sonda química de molécula pequeña para la biología celular del receptor nuclear hem Rev-erbα

La identificación de ligandos sin porfirina para el receptor nuclear huérfano Rev-erbα permitirá estudiar su función como sensor hem y regulador de la señalización metabólica y circadiana. Describimos el desarrollo de un ensayo bioquímico que mide la interacción entre Rev-erbα y un péptido del receptor nuclear corepressor-1 (NCoR). El ensayo se utilizó para identificar un ligando de molécula pequeña para Rev-erbα, GSK4112 (1), que era competitivo con el hemo. En las células, 1 perfilado como un agonista de Rev-erbα en las células para inhibir la expresión del gen diana circadiano bmal1. Además, 1 reprimió la expresión de genes gluconeogénicos en las células del hígado y redujo la producción de glucosa en los hepatocitos primarios. Por lo tanto, 1 es útil como herramienta química para probar la función de Rev-erbα en la represión transcripcional, la regulación de la biología circadiana y las vías metabólicas. Además, 1 puede servir como punto de partida para el diseño de sondas químicas Rev-erbα con actividad farmacológica in vivo.


Dirigido a moléculas pequeñas de la actividad de unión al ARN de MUSASHI en la leucemia mieloide aguda

La familia MUSASHI (MSI) de proteínas de unión a ARN (MSI1 y MSI2) contribuye a un amplio espectro de cánceres, incluida la leucemia mieloide aguda. Encontramos que la molécula pequeña Ro 08-2750 (Ro) se une directa y selectivamente a MSI2 y compite por su unión de ARN en ensayos bioquímicos. El tratamiento con Ro en células de leucemia mieloide humana y de ratón da como resultado un aumento en la diferenciación y apoptosis, inhibición de objetivos MSI conocidos y una firma de expresión génica global compartida similar a la depleción del ARNhc de MSI2. Ro demuestra la inhibición in vivo de c-MYC y reduce la carga de enfermedad en un modelo de leucemia de LMA murina. Por lo tanto, identificamos una pequeña molécula que se dirige a la actividad oncogénica de MSI. Nuestro estudio proporciona un marco para dirigirse a las proteínas de unión al ARN en el cáncer.

Declaracion de conflicto de interes

J.D.C. es miembro del Consejo Asesor Científico de Schrödinger. Los autores restantes declaran no tener intereses en competencia.

Cifras

Ro 08-2750 (Ro) es un inhibidor selectivo de la actividad de unión al ARN de MSI. a Polarización de fluorescencia ...

Ro interactúa con el reconocimiento de ARN ...

Ro interactúa con el motivo de reconocimiento de ARN 1 (RRM1) de MSI2. a Superficie de proteína ...

Ro 08-2750 aumenta la diferenciación y ...

Ro 08-2750 aumenta la diferenciación y la apoptosis en las células de leucemia mieloide. a Ensayo de citotoxicidad ...

El tratamiento con Ro 08-2750 inhibe la supervivencia ...

El tratamiento con Ro 08-2750 inhibe la supervivencia de las líneas celulares de AML humana y las células de los pacientes.…

El tratamiento Ro 08-2750 corresponde con…

El tratamiento con Ro 08-2750 se corresponde con la firma génica empobrecida en ARNhc de MSI2. a Esquema de ...

Ro 08-2750 demuestra eficacia en ...

Ro 08-2750 demuestra eficacia en un modelo in vivo MLL-AF9. a Esquema de ...


Introducción

Los ácidos ribonucleicos (ARN) desempeñan un papel fundamental en muchos procesos celulares, como la transmisión de información genética, la detección y comunicación de respuestas a señales celulares e incluso la catálisis de reacciones químicas [1]. Estos procesos suelen estar modulados por otras moléculas, como iones o moléculas pequeñas, lo que convierte al ARN en un objetivo terapéutico atractivo para nuevos fármacos [2-4]. Un ejemplo bien estudiado y validado clínicamente es el ribosoma bacteriano, un objetivo molecular para muchos antibióticos [5]. Los ribosconmutadores, una clase de elementos estructurales de ARN reguladores incrustados en regiones no traducidas de ARNm, comprenden otro grupo interesante de objetivos de ARN. Estos elementos estructurales pueden unirse directamente a un ligando para regular la función de los genes sin la necesidad de cofactores de proteínas [6, 7]. Los riboswitches son comunes en las células bacterianas y rara vez ocurren en las células eucariotas, lo que los convierte en objetivos adecuados para nuevos fármacos antibacterianos. Un ejemplo bien estudiado es el FMN riboswitch, que controla la expresión de genes necesarios para la biosíntesis y el transporte de riboflavina (vitamina B2) en bacterias [8]. Se han identificado varios inhibidores de moléculas pequeñas del riboswitch FMN con propiedades antibacterianas comprobadas. Algunos de estos inhibidores de moléculas pequeñas incluyen compuestos como la roseoflavina [9,10] o 5FDQD [11], que son estructuralmente similares al ligando natural, así como ligandos estructuralmente diferentes que tienen un quimiotipo diferente, por ejemplo, ribocil y sus derivados [ 12]. Además de los riboconmutadores, otros ARN de importancia médica incluyen ARN víricos (sitio de inicio de dimerización del ARN del VIH-1 [13]), intrones del grupo I de autoempalme (p. Ej., Un inhibidor de la td intrón ARN [14]), intrones del grupo II (p. ej., inhibidores del corte y empalme de intrones del grupo IIB [15]) y ribozimas virales (p. ej., inhibición de las ribozimas del virus de la hepatitis D por los aminoglucósidos [16]) (para obtener más detalles, consulte [17]) .

El esclarecimiento del papel de las interacciones ARN-ligando y el diseño de nuevas moléculas de unión a ARN pueden facilitarse mediante el análisis de estructuras tridimensionales (3D) del ARN de interés o su complejo con un ligando. Desafortunadamente, la determinación experimental de estructuras 3D es una tarea intensiva y, a menudo, tiene que ser apoyada por modelos computacionales [18] o realizada por completo. en silico (para una revisión de los métodos de modelado de interacciones entre ácido ribonucleico y ligando, ver: [19]). Estas limitaciones, junto con un creciente interés en el ARN como objetivo de la intervención terapéutica, resaltan la necesidad de desarrollar nuevos métodos para predecir la estructura 3D de los complejos ARN-ligando.

Uno de los métodos computacionales más utilizados para predecir las estructuras 3D de macromoléculas con ligandos es el acoplamiento molecular [20, 21]. Muchos de los programas de acoplamiento disponibles en la actualidad se diseñaron inicialmente para el acoplamiento proteína-proteína o proteína-ligando (p. Ej., Como AutoDock [22], AutoDock Vina [23], ICM [24] o iDock [25]) mientras que algunos de ellos posteriormente se adaptaron o reparametrizaron para permitir el acoplamiento ARN-ligando, donde el ARN se especifica como receptor (Dock6, [26], ICM [27] o AutoDock [28]). Se diseñaron y optimizaron algunos programas específicamente para acoplar ligandos al ARN. MORDOR permite la flexibilidad del ligando y del receptor y utiliza una función de puntuación que estima la energía total de los complejos y consta de varios términos (electrostático, van der Waals, ángulo diedro, ángulo de torsión, enlace y Urey-Bradley) [29]. rDock (anteriormente: RiboDock) consiste en un motor de búsqueda estocástico de algoritmo genético como generador de pose, y una función de puntuación intermolecular validada contra objetivos de proteínas y ARN [30,31]. El componente principal de esta función de puntuación es un potencial de van der Waals, un término empírico para interacciones polares atractivas y repulsivas, y un potencial de desolvatación opcional que combina un enfoque ponderado de área de superficie accesible al solvente. El programa rDock también se puede utilizar para volver a puntuar poses generadas por una herramienta externa.

En una cartera de métodos que facilitan la predicción de estructuras de ligando de ARN en 3D, también hay funciones de puntuación independientes específicas para complejos de ligando de ARN, destinadas a ser utilizadas para la restitución de modelos generados por acoplamiento molecular. Un grupo separado de tales métodos consta de potenciales estadísticos (funciones de puntuación estadística o potenciales basados ​​en el conocimiento), que se derivan de un análisis de estructuras resueltas experimentalmente. Pfeffer y Gohlke desarrollaron una función de puntuación denominada DrugScore RNA, que emplea un potencial dependiente de la distancia calculado sobre la base de los contactos entre los átomos del ligando y del receptor [32]. Ambos socios que interactúan están en representación de todos los átomos utilizando tipos de átomos Tripos. Del mismo modo, una función de puntuación de KScore, descrita por Zhao et al., también es un potencial dependiente de la distancia, que además del conjunto estándar de tipos de átomos de Tripos, utiliza un conjunto de tipos de átomo extendido para caracterizar mejor las interacciones metal-ligando y agua-ligando. Asimismo, define un esquema especial de tipificación de átomos para ácidos nucleicos, y se parametrizó en complejos de ligandos con proteínas (2422 complejos), ADN (300 complejos) y ARN (97 complejos). Yan y Wang describieron una función de puntuación dependiente de la distancia denominada SPA-LN, donde los tipos de átomos Tripos se utilizan para la representación de ARN y ligandos [33]. Durante la optimización de los parámetros, se centraron no solo en recapitular la pose casi nativa del ligando, sino también en la estimación de la afinidad. Mejorar las predicciones de afinidad era un objetivo de Chen et al., autores de las funciones iMDLScore1 e iMDLScore2 [34]. Optimizaron los términos de puntuación de AutoDock4.1 utilizando métodos de regresión multilineal y datos de afinidad de unión para 45 complejos de ARN. Nuestro grupo desarrolló LigandRNA, un potencial estadístico anisotrópico dependiente de la distancia y el ángulo [35]. Se derivó de un conjunto diversificado de 251 complejos ARN-ligando resueltos experimentalmente y utilizó la representación de todos los átomos con los tipos de átomos de Tripos. Se demostró que es superior a las funciones de puntuación descritas anteriormente en términos de precisión para encontrar una conformación casi nativa de ligandos. Chhabra et al. en la RNAPosers utilizaron una huella digital dependiente de la distancia para describir una pose de unión de un ligando en el bolsillo de unión de ARN [36]. Los datos derivados de 80 complejos de ARN-ligando resueltos experimentalmente se utilizaron para entrenar un algoritmo de aprendizaje automático, que luego se utilizó para clasificar las poses de acoplamiento. De manera similar a los programas descritos anteriormente, RNAPosers usa una representación de todos los átomos con los tipos de átomos Tripos.

En este estudio, describimos AnnapuRNA, una nueva función de puntuación basada en el conocimiento diseñada para evaluar estructuras complejas de ARN-ligando, generadas por cualquier método de acoplamiento computacional. También presentamos un punto de referencia en el que comparamos AnnapuRNA con otras funciones de puntuación disponibles. Presentamos un caso de estudio en el que utilizamos el acoplamiento molecular en combinación con la función de puntuación AnnapuRNA para predecir una estructura recientemente publicada de un riboswitch FMN cocristalizado con un nuevo inhibidor de molécula pequeña. Nuestro método predijo con éxito la estructura de este complejo basado en la estructura previamente publicada de FMN en complejo con un ligando diferente, así como la estructura de apo de baja resolución de este ARN.

AnnapuRNA está disponible gratuitamente para la comunidad científica en https://github.com/filipspl/AnnapuRNA.


Una pequeña molécula RAS-mimético altera la asociación de RAS con proteínas efectoras para bloquear la señalización

La activación oncogénica de genes RAS a través de mutaciones puntuales ocurre en 20% -30% de los cánceres humanos. El desarrollo de inhibidores de RAS efectivos ha sido un desafío, lo que requiere nuevos enfoques para inhibir esta proteína oncogénica. Los estudios funcionales han demostrado que la región de cambio de RAS interactúa con un gran número de proteínas efectoras que contienen un dominio de unión a RAS (RBD) común. Debido a que las interacciones mediadas por RBD son esenciales para la señalización de RAS, el bloqueo de la asociación de RBD con moléculas pequeñas constituye un enfoque terapéutico atractivo. Aquí, presentamos evidencia de que rigosertib, una estiril-bencil sulfona, actúa como un mimético de RAS e interactúa con los RBD de las quinasas RAF, lo que resulta en su incapacidad para unirse a RAS, interrupción de la activación de RAF e inhibición de RAS-RAF. -Vía MEK. También encontramos que el ribosertib se une a los RBD de Ral-GDS y PI3K. Estos resultados sugieren que el objetivo de RBD a través de múltiples vías de señalización por rigosertib puede representar una estrategia eficaz para la inactivación de la señalización RAS.

Palabras clave: MAPK PI3K RAF RAS Dominio de unión a RAS rigosertib.

Copyright © 2016 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

Cifras

Figura 1. Rigosertib se une a los RBD ...

Figura 1. Rigosertib se une a los RBD de c-RAF y B-RAF

Figura 2. Análisis de RMN del B-RAF ...

Figura 2. Análisis de RMN de la interacción B-RAF RBD-Rigosertib: estudios de perturbación por desplazamiento químico y RMN ...

Figura 3. Rigosertib interactúa con β1…

Figura 3. Rigosertib interactúa con la hebra β1, la hebra β2 y la hélice α1 de…

Figura 4. El rigosertib interfiere con el factor de crecimiento inducido ...

Figura 4. El rigosertib interfiere con la dimerización de RAF inducida por el factor de crecimiento y la activación de MEK / ERK

Figura 5. Tratamiento de células tumorales humanas ...

Figura 5. El tratamiento de células tumorales humanas con rigosertib inhibe la fosforilación de c-RAF Ser338 e inhibe ...

Figura 6. Rigosertib inhibe la transformación mediada por RAS y ...

Figura 6. Rigosertib inhibe la transformación mediada por RAS y el crecimiento tumoral

(A) El rigosertib inhibe la transformación del pollo ...

Figura 7. El tratamiento con rigosertib suprime el…

Figura 7. El tratamiento con rigosertib suprime el crecimiento de la neoplasia intraepitelial pancreática impulsada por RAS


Abstracto

Un enfoque alternativo para promover la cristalización de proteínas es mejorar los contactos intermoleculares entre macromoléculas o eliminar interacciones intermoleculares o interacciones con solventes que podrían inhibir la cristalización. Se han empleado mutaciones específicas de sitio, al igual que truncamientos por medios genéticos o proteolíticos. Sin embargo, existen problemas importantes. Debido a que se desconoce la estructura de la macromolécula diana, puede que no haya una buena base para el diseño de mutantes o truncamientos. Además, el enfoque requiere que la proteína se produzca mediante tecnología de ADN recombinante, lo que con frecuencia no es el caso. Hemos intentado abordar estos problemas iniciando experimentos basados ​​en dos ideas. La primera es que se podría introducir sistemáticamente una amplia variedad de moléculas pequeñas convencionales en las aguas madres durante el cribado de cristalización. Mediante la incorporación a la red cristalina, las interacciones intermoleculares adicionales que proporcionan las moléculas pequeñas podrían mejorar la nucleación y el crecimiento de los cristales. Un segundo enfoque que estamos siguiendo es la modificación química de varias cadenas laterales de aminoácidos utilizando la química de proteínas tradicional. Creemos que en algunos casos se podría inducir a las proteínas modificadas químicamente a cristalizar o cristalizar mejor que la proteína nativa.


Una pequeña molécula dirigida a la síntesis de translesiones mutagénicas mejora la quimioterapia

La farmacorresistencia intrínseca y adquirida y la inducción de neoplasias malignas secundarias limitan el éxito de la quimioterapia. Debido a que la síntesis de translesión mutagénica (TLS) contribuye a la quimiorresistencia, así como a las mutaciones inducidas por el tratamiento, dirigirse a TLS es una vía atractiva para mejorar la quimioterapia. Sin embargo, el desarrollo de moléculas pequeñas con alta especificidad y eficacia in vivo para TLS mutagénico ha sido un desafío. Aquí, informamos el descubrimiento de un inhibidor de molécula pequeña, JH-RE-06, que interrumpe el TLS mutagénico al prevenir el reclutamiento de POL ζ mutagénico. Sorprendentemente, JH-RE-06 apunta a una superficie casi sin rasgos distintivos de REV1 que interactúa con la subunidad REV7 de POL ζ. La unión de JH-RE-06 induce la dimerización de REV1, que bloquea la interacción REV1-REV7 y el reclutamiento de POL ζ. JH-RE-06 inhibe el TLS mutagénico y mejora la toxicidad inducida por cisplatino en líneas de células cultivadas de humanos y ratones. La coadministración de JH-RE-06 con cisplatino suprime el crecimiento de melanomas humanos de xenoinjerto en ratones, estableciendo un marco para el desarrollo de inhibidores de TLS como una nueva clase de adyuvantes de quimioterapia.

Palabras clave: POL ζ REV1 REV7 quimioterapia quimiorresistencia síntesis de translesión de cisplatino.

Copyright © 2019 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

Declaracion de conflicto de interes

P.Z. y J.H. son inventores de una patente sobre JH-RE-06. Los autores restantes declaran no tener intereses en competencia.

Cifras

Figura 1 .. Descubrimiento y caracterización de JH-RE-06,…

Figura 1 .. Descubrimiento y caracterización de JH-RE-06, un inhibidor de molécula pequeña que bloquea el REV1…

Figura 2 .. Caracterización estructural y bioquímica de…

Figura 2 .. Caracterización estructural y bioquímica del complejo cREV1 CTD / JH-RE-06.

Figura 3 .. JH-RE-06 mejora la citotoxicidad del cisplatino y ...

Figura 3. JH-RE-06 mejora la citotoxicidad del cisplatino y suprime la mutagénesis inducida por cisplatino.

Las células se trataron con DMSO ...

Figura 4 .. JH-RE-06 sensibiliza las células al cisplatino ...

Figura 4 .. JH-RE-06 sensibiliza las células al cisplatino y reduce las mutaciones de HPRT de una manera dependiente de REV1.

Figura 5 .. JH-RE-06 mejora la respuesta de las células tumorales…

Figura 5. JH-RE-06 mejora la respuesta de las células tumorales al cisplatino en un modelo de ratón de xenoinjerto.


Abstracto

Los procesos celulares que sustentan la vida están orquestados por proteínas y sus interacciones. La heterogeneidad estructural y dinámica asociada, a pesar de ser clave para su funcionamiento, plantea un desafío fundamental a las metodologías analíticas y estructurales existentes. Usamos microscopía de dispersión interferométrica para cuantificar la masa de biomoléculas individuales en solución con una precisión de masa de secuencia del 2%, una resolución de hasta 19 kilodalton y una precisión de 1 kilodalton. Resolvimos distribuciones oligoméricas en un rango dinámico alto, detectamos unión de moléculas pequeñas y proteínas con imágenes de masa con lípidos y azúcares asociados. Estas capacidades nos permitieron caracterizar la dinámica molecular de procesos tan diversos como el entrecruzamiento de glicoproteínas, la agregación de proteínas amiloidogénicas y la polimerización de actina. La espectrometría de masas de dispersión interferométrica permite la medición resuelta espacio-temporal de una amplia gama de interacciones biomoleculares, una molécula a la vez.

Las interacciones y ensamblajes biomoleculares son fundamentales para una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos que abarcan escalas de longitud desde pequeños complejos (1) a la mesoescala (2, 3). A pesar de los considerables avances en las técnicas capaces de proporcionar información estructural de alta resolución (4), estas técnicas son típicamente estáticas, implican promediar muchas moléculas en la muestra y, por lo tanto, a menudo no capturan completamente la diversidad de estructuras e interacciones. Los métodos de conjuntos basados ​​en soluciones permiten estudios dinámicos pero carecen de la resolución de separación requerida para distinguir diferentes especies (57). Los métodos de una sola molécula ofrecen un medio para eludir la heterogeneidad tanto en la estructura como en la dinámica, y se ha avanzado en términos de caracterizar las interacciones (8) y mecanismos (9, 10). Sin embargo, hasta ahora, ningún enfoque de molécula única ha sido capaz de cuantificar y seguir la diversidad de interacciones de biomoléculas con la precisión y resolución espacio-temporal requeridas.

Dada la suficiente sensibilidad, la dispersión de la luz es un medio ideal para detectar y caracterizar moléculas en condiciones in vitro de baja dispersión debido a su aplicabilidad universal. En un esquema de detección interferométrica (Fig. 1A), la señal de dispersión escala con la polarizabilidad, que es una función del índice de refracción y proporcional al volumen de partículas (11). Combinando la aproximación de que los aminoácidos individuales se comportan efectivamente como nanoobjetos individuales con la observación de que los volúmenes específicos de aminoácidos y los índices de refracción de las proteínas varían solo en

1% (fig. S1 y tabla S1) sugiere que el número de aminoácidos en un polipéptido, y por tanto su masa, son proporcionales a su señal de dispersión. Esta estrecha relación entre masa y contraste interferométrico, que se ha predicho (12, 13) y observado (14, 15) para mantener groseramente incluso en el nivel de una sola molécula, por lo tanto, en principio, podría usarse para lograr una alta precisión de masa.

(A) Esquema del enfoque experimental que se basa en la inmovilización de moléculas individuales cerca de una interfaz de índice de refracción. Los estados oligoméricos se colorean de manera diferente para mayor claridad. (B) Imagen de dispersión interferométrica diferencial de BSA. Barra de escala, 0,5 μm. (C) Imágenes representativas de monómeros (arriba a la izquierda), dímeros (abajo a la izquierda), trímeros (arriba a la derecha) y tetrámeros (abajo a la derecha) de BSA. Barras de escala, 200 nm. (D) Gráfico de dispersión de eventos de unión de una sola molécula y sus contrastes de dispersión para BSA 12 nM de 14 películas (panel inferior). Histograma correspondiente (norte = 12,209) con una vista ampliada de la región para especies más grandes (panel superior). La reducción en la tasa de aterrizaje resulta de una caída en la concentración de BSA con el tiempo debido a la gran relación superficie-volumen de nuestra celda de muestra (materiales suplementarios).

Sobre la base de los avances recientes en el enfoque experimental (fig. S2) que mejoró los contrastes de imágenes para la microscopía de dispersión interferométrica (15, 16), pudimos obtener imágenes de alta calidad de proteínas individuales a medida que se difundían desde la solución para unirse de manera inespecífica a la interfaz del cubreobjetos / solución del microscopio (Fig.1, B y C, y película S1). Alcanzar relaciones señal / ruido & gt10, incluso para proteínas pequeñas como la albúmina de suero bovino (BSA), junto con un enfoque de análisis de datos optimizado (16), nos permitió extraer el contraste de dispersión para cada evento de unión molecular con alta precisión (Fig. 1D y Fig. S3). Estos datos revelaron firmas claras de diferentes estados oligoméricos de BSA, con abundancias relativas de monómero a tetrámero de 88,63, 9,94, 1,18 y 0,25% de las partículas detectadas. Para la unión inespecífica a un cubreobjetos de microscopio no funcionalizado, la unión a la superficie fue efectivamente irreversible (12,209 eventos de unión frente a 372 eventos de desvinculación). Como resultado, pudimos determinar las constantes de velocidad de unión (en masa), que generalmente exhibían solo pequeñas variaciones con el estado oligomérico. Estos podrían adaptarse para obtener correcciones menores a los espectros de masas registrados y producir la distribución de la solución (fig. S4). Nuestros resultados, incluida la detección y cuantificación de complejos raros como los tetrámeros de BSA, demuestran la capacidad de la espectrometría de masas de dispersión interferométrica (iSCAMS) para caracterizar distribuciones de soluciones de especies oligoméricas y complejos moleculares en un rango dinámico alto.

El espaciado regular en el histograma de contraste de BSA confirma provisionalmente la escala lineal esperada entre la masa y el contraste interferométrico. La repetición de estas medidas para ocho proteínas diferentes, que abarcan de 53 a 803 kDa, valida la relación lineal (Fig. 2A y Fig. S5A). La desviación entre la masa medida y la secuencia fue & lt5 kDa, dando como resultado un error promedio del 1,9%, y esta desviación no mostró correlación detectable con la refractividad en relación con la forma general de la molécula (figura S6A). Incluso para grandes diferencias estructurales, como aquellas entre las conformaciones extendidas y plegadas de la miosina del músculo liso (530.6 kDa Fig. 2A y figuras S5B y S7), no encontramos diferencias medibles en la masa molecular aparente más allá del aumento esperado para la adición de moléculas de glutaraldehído utilizadas para reticular la miosina en la conformación plegada (extendida, 528,4 ± 16,2 kDa plegada, 579,4 ± 14,8 kDa, fig. S5B). La resolución, definida por el ancho completo a la mitad del máximo del contraste medido, alcanzó 19 kDa para la estreptavidina. En todos los casos, la resolución estuvo limitada por el ruido de los disparos de fotones e influenciada por la masa molecular, aumentando de 19 kDa para la estreptavidina a 102 kDa para la tiroglobulina (fig. S6, B y C). La desviación de & lt0.5% de la masa de secuencia para especies de & gt100 kDa se compara bien con la espectrometría de masas nativa (17) y demuestra la utilidad intrínseca de iSCAMS para la medición de masa precisa de biomoléculas con resolución oligomérica.

(A) Contraste versus masa molecular, incluso para proteínas utilizadas para calibración de masa (negro), caracterización de dependencia de forma (amarillo), unión proteína-ligando (verde), composición de nanodiscos de lípidos (rojo) y glicosilación (azul). El error de masa (panel superior) se da como un porcentaje de la masa de la secuencia en relación con el ajuste lineal dado. (B) Medición de la masa de nanodiscos para diferentes composiciones lipídicas y cinturones proteicos. Las masas obtenidas por metodologías alternativas para MSP1D1 / DMPC se marcan y extrapolan a las otras composiciones. Las barras horizontales indican el rango de masa esperado en función de la técnica de caracterización, las barras delgadas indican el contraste medido y las barras gruesas representan la incertidumbre de la medición en términos del error estándar de la media (SEM) para experimentos repetidos. Para cada muestra, el texto superior denota la proteína de andamio de membrana (MSP) utilizada, y el texto inferior indica los lípidos en el nanodisco. (C) Contraste diferencial registrado para Env expresado en presencia o ausencia de kifunensina y rangos de masa asociados esperados para diferentes niveles de glicosilación. (D) Detección sensible a la masa de la unión del ligando en el sistema biotina-estreptavidina, según la masa secuencial de estreptavidina y las masas de biotina y dos péptidos biotinilados en relación con la calibración obtenida de (A). Las abreviaturas se definen en la tabla S8. En (A) y (D), las barras de error representan SEM.

Más allá de las especies compuestas únicamente por aminoácidos, los nanodiscos de lípidos son un sistema ideal para probar la amplia aplicabilidad de iSCAMS debido a su flexibilidad en términos de contenido de polipéptidos y lípidos (18). Para nanodiscos compuestos por la proteína del cinturón MSP1D1 y DMPC (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina), obtuvimos una masa de 141,0 ± 1,6 kDa, en buen acuerdo con el rango de masas que van de 124 a 158 kDa reportados por otros métodos (Fig. 2B y Fig. S5D). Reemplazar MSP1D1 con MSP1ΔH5 más pequeño redujo el diámetro del nanodisco y el contenido de lípidos en

20%, después de tener en cuenta el grosor del cinturón de proteínas (19). Dadas las masas de MSP1D1 y MSP1ΔH5 (47 y 42 kDa, respectivamente), predijimos una masa para el nanodisco MSP1ΔH5 de 113,6 kDa, en excelente acuerdo con nuestra medición (114,1 ± 1,9 kDa). Los cambios de masa asociados con cambios en la composición de lípidos, como los introducidos por los lípidos parcialmente insaturados y el colesterol, coincidieron con los predichos de las proporciones de ensamblaje (Fig. 2B y tablas S2 a S6).

Para ver si nuestro enfoque también se aplica a restos expuestos a solventes que experimentan un ambiente dieléctrico diferente de aquellos enterrados dentro de una proteína, seleccionamos el complejo de glicoproteína de la envoltura del VIH (Env), que es un trímero de heterodímeros gp41-gp120. La env está ampliamente N-glicosilada, y los carbohidratos aportan casi la mitad de su masa (20). Para un imitador del trímero Env expresado en presencia de kifunensina, un inhibidor de manosidasa que conduce predominantemente a Man9GlcNAc2 glucanos (hombre, manosa GlcNAc, norte-acetilglucosamina) (fig. S8), registramos una masa de 350,0 ± 5,7 kDa. Haciendo la aproximación cruda de que los glicanos y los aminoácidos tienen polarizabilidades similares, esto corresponde a una ocupación de glicanos de 74 ± 3 de 84 sitios posibles (Fig. 2C y Fig. S5E), consistente con observaciones recientes de alta ocupación para gp120 expresada con kifunensina. (21). Para Env expresado sin kifunensina, registramos una masa menor de 315,3 ± 10,5 kDa. La diferencia de masa se puede atribuir solo en parte a la masa promedio más baja de los glicanos procesados ​​(fig. S8) y produce un total norte-Ocupación de glicanos de 61 ± 6. Aunque los valores exactos de ocupación están en deuda con nuestra calibración (Fig. 2A), la presencia de sitios desocupados es consistente con su observación en los datos proteómicos (22).

La alta precisión de 1,8 ± 0,5% con respecto a la masa de proteína (Fig. 2A) indica el potencial para la detección directa de la unión de moléculas pequeñas. Para probar los límites actuales de iSCAMS en términos de precisión, examinamos el sistema biotina-estreptavidina (Fig. 2D y Fig. S5C). Medimos masas de estreptavidina en ausencia (55,7 ± 1,1 kDa) y presencia (57,4 ± 0,9 kDa) de biotina, encontrando una diferencia de 1,7 ± 1,4 kDa, en buen acuerdo con los 0,98 kDa esperados para la ocupación completa de los cuatro sitios de unión. . Tras la adición de dos péptidos biotinilados diferentes (3705,9 y 4767,4 Da), encontramos aumentos de 16,1 ± 2,8 y 22,0 ± 2,2 kDa (en comparación con los 14,8 y 19,1 kDa esperados) (Fig. 2D y Fig. S5C). Estos datos muestran que iSCAMS puede detectar la asociación de ligandos del tamaño de un kilodalton, lo que demuestra su idoneidad para estudios sensibles de unión de ligandos en solución.

Después de haber establecido las capacidades de iSCAMS, buscamos probarlo en sistemas más complejos que son difíciles de evaluar cuantitativamente con las técnicas existentes como consecuencia de la heterogeneidad y los mecanismos de ensamblaje de múltiples pasos (Fig. 3). Además, nuestro objetivo era monitorear la dinámica de nucleación y polimerización de estructuras mesoscópicas hasta el nivel de una sola molécula, lo cual es un desafío debido al requisito simultáneo de alto rango dinámico, alta velocidad de imagen y correlación directa entre las señales observadas y la molécula asociada. eventos. El sistema biotina-estreptavidina exhibe una unión casi covalente, lo que plantea la cuestión de si iSCAMS es capaz no solo de determinar distribuciones de masa, sino también de cuantificar equilibrios más débiles, como se encuentra a menudo en las interacciones proteína-proteína.

(A) Distribuciones de masa para Env en presencia de monómero BanLec de 0,5 a 40 nM, junto con las posiciones esperadas para múltiplos de tetrámeros BanLec unidos. Recuadro, una vista ampliada de la región para especies más grandes. (B) Fracciones oligoméricas coloreadas según (A) frente a la concentración de BanLec, incluidas las predicciones (curvas) utilizando el modelo que se muestra.

Por lo tanto, investigamos la interacción de Env con la lectina antiviral BanLec, que neutraliza el VIH al unirse a la superficie norte-glicanos (23, 24) a través de un mecanismo desconocido. Pudimos monitorear las interacciones y los complejos de vida corta antes de la agregación, con la adición de BanLec a Env, lo que resultó en una reducción de unidades Env individuales junto con la aparición de dímeros y ensamblajes de orden superior (Fig. 3A). Describir la evolución oligomérica experimental con un modelo simple (Fig. 3B) nos permitió extraer las constantes de asociación subyacentes [KBanLec = 0,12 nM −1 KEnv = 8 nM −1 KBanLec = 0,4 nM −1 (como se define en la Fig. 3B)], de acuerdo con estudios masivos recientes (KBanLec = 0.19 nM −1), que también encontró firmas de un evento de enlace secundario (2.85 nM −1) (25). Nuestra capacidad para seguir y modelar la evolución de diferentes especies oligoméricas nos permitió extraer el mecanismo de interacción y la energía subyacente a la interacción lectina-glicoproteína, a pesar de la heterogeneidad de este sistema multicomponente. Como resultado, podríamos mostrar que la vinculación de Env a BanLec que ya está vinculada a Env (KEnv) es mucho más fuerte que liberar BanLec (KBanLec), una característica clave del comportamiento cooperativo. Además, la resolución de masa de nuestro enfoque nos permitió cuantificar el número de BanLecs unidos por dímero (uno a dos), trímero (dos a tres) y tetrámero (tres a cuatro) de Env, lo que demuestra la unión bivalente. Estos resultados son directamente relevantes para la caracterización y optimización de los antirretrovirales, dado que se ha propuesto que la multivalencia y la agregación están vinculadas a la potencia de neutralización (25). Anticipamos que se podrán lograr conocimientos cuantitativos similares para otras proteínas diana terapéuticas y las interacciones proteína-proteína en general.

Una ventaja de nuestro enfoque basado en imágenes es su capacidad para resolver cambios de masa en el tiempo de una manera sensible a la posición y la concentración local. Esto nos permite examinar los eventos de nucleación catalizados en la superficie que eventualmente pueden conducir a la formación de amiloide (26). Estudios previos que utilizaron el etiquetado de fluorescencia encontraron agregados de

0,6 μm de diámetro dentro de un minuto de la adición de la proteína amiloidogénica α-sinucleína a 10 μM a una bicapa debidamente cargada (27). Al agregar α-sinucleína a un DOPC plano, cargado negativamente (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) / DOPS (1,2-dioleoil-sn-glycero-3-phospho- l -serine) (3:1) membrane at physiological pH, we observed the appearance and growth of nanoscopic objects within seconds, even at low micromolar concentrations (Fig. 4A and movie S2). We were unable to determine the sizes of the initial nucleating species or individual assembly steps owing to the low molecular mass of α-synuclein (14 kDa), but we could monitor the nanoscale formation of associated structures in the range of hundreds of kilodaltons and determine the kinetics (Fig. 4B). Growth of these clusters was uniform across the field of view, with the initial rates following expectations for a first-order process (Fig. 4B and fig. S9A), pointing to a simple growth mechanism. We did not detect such structures on neutral, DOPC-only bilayers, and we found evidence for thioflavin T–positive aggregates after overnight incubation (fig. S9B), suggesting that our assay probes early stages of amyloid assembly.

(A) Schematic and iSCAMS images of α-synuclein (1 μM) aggregation on a negatively charged bilayer membrane. (B) Initial growth rate versus α-synuclein concentration, shown with the best fit assuming first-order kinetics. Error bars denote SEM for different particles. Inset, individual (gray) and average (black) growth trajectories for 21 particles from (A). (C) Schematic and iSCAMS images of actin polymerization. The arrow highlights a growing filament. (D) Representative traces of actin filament tip position (gray) and corresponding detected steps (black). (mi) Step and mass histogram from 1523 steps and 33 filaments, including a fit to a Gaussian mixture model (black) and individual contributions (colored according to fig. S10G). Scale bars, 1 μm. In these experiments, background correction involved removal of the static background before acquisition, rather than continuous differential imaging as in Figs. 2 and 3 (supplementary materials).

At the extremes of its current sensitivity, iSCAMS enables mass imaging of mesoscopic self-assembly, molecule by molecule. In an actin polymerization assay, subtraction of the constant background revealed the growth of surface-immobilized filaments. In contrast to α-synuclein, where the growth of interest took place within a diffraction-limited spot, in this case we could quantify length changes of filaments larger than the diffraction limit upon the attachment and detachment of actin subunits (Fig. 4C, fig. S10C, and movie S3). We observed distinct, stepwise changes in the filament length (Fig. 4D fig. S10, D to F and movie S4), the most frequent forward and backward step sizes in the traces being 3.0 ± 0.8 and 2.7 ± 0.7 nm, respectively—very close to the expected length increase of 2.7 nm upon binding of a single actin subunit to a filament (Fig. 4E). Detection of larger step sizes represents the addition of multiple actin subunits within our detection time window. The contrast changes associated with the different step sizes corresponded to mass changes of one, two, or three actin monomers binding to (and unbinding from) the tip of the growing filaments during acquisition (fig. S10, G and H). Even though we cannot yet distinguish between models invoking monomer (28) or oligomer (29) addition to a growing filament at the current level of spatiotemporal resolution, these results demonstrate the capability of iSCAMS to quantitatively image mesoscopic dynamics and determine how they are influenced by associated proteins at the single-molecule level.

We anticipate that combining iSCAMS with established surface modifications (30) will dramatically expand its capabilities. Passivation decreases surface binding probabilities and thereby should provide access to much higher analyte concentrations (greater than micromolar), and surface activation will reduce measurement times at low concentrations (less than nanomolar). Specific functionalization and immobilization of individual subunits or binding partners could allow for the determination of on and off rates, in addition to equilibrium constants, and enable targeted detection in the presence of other analytes (14). Although studies within complex three-dimensional environments such as the cell may prove to be beyond reach, the advances reported here will make iSCAMS a key approach for dynamic in vitro studies of biomolecular interactions, assembly, and structure at the single-molecule level.


ADVICE ON EXPERIMENTAL DESIGN

An ideal binding experiment has a fixed total concentration of one of the two reactants, let's choose A, that is lower than the KD. Ten-fold lower than the KD está bien. Using a low concentration of total A simplifies the execution of the experiment and interpretation of the data, because essentially all of the other reactant B is free under all conditions. The practical limitation is that the assay must be able to measure the concentration of free or bound A.

If one chooses a low concentration of total A, then the experiment is to determine the extent of the reaction over a wide range of concentrations of B. When the concentration of B is below the KD, most of B is free, because, given the low concentrations of both reactants, little binding will occur. At higher concentrations of B more AB forms, but the concentration of A is so low that virtually all of B is free. Because most of B is free both below and above the KD, Bgratis ∼ Btotal one does not have to compensate for any B bound to A when analyzing the data.

If the assay lacks the sensitivity to do the experiment with a concentration of A below the KD, then use the lowest practical concentration of A. Later, when analyzing the data (see below), compensate for the finite amount of B bound to A at each concentration of total B in the sample.


Binding a Macromolecule M with a Small Molecule L - Biology

The multiple equilibria for the binding of a ligand A by a macromolecule P with n binding sites may be formulated in terms of a stoichiometric analysis or on the basis of a site-oriented scrutiny. The dependence of binding on ligand concentration can always be correlated in terms of n stoichiometric binding constants,Ki, even if there are interactions between sites that accentuate or attenuate binding affinities. A corresponding correlation in terms of site binding constants, kj, under the most general circumstances depends on the definition of n2n-1 different constants of which 2n-1 are independent. If experimental data are correlated in terms of n parameters kalpha, kbeta . klambda in an equation of the site-binding form, (see article for formular) then there is no guarantee that the values of ka, kb, etc., have any unique relationships to site binging constants. Examples are given to illustrate this point. Equation are derived for relating stoichiometric binding constants to site binding constants, for the general case and for various special circumstances. These equations make it possible to define and analyze binding insystems with interactions and conformational accommodations. Accordingly, a graphical procedure is described (in which iKi is plotted against i, the stoichiometric binding step) that provides an affinity profile for concise representation of magnitudes of binding constants and for detecting interactions that accentuate or attenuate site binding affinities.


Ver el vídeo: Επική περιγραφή από Αλβανούς παίχτες ΡΟΥΚ ΖΟΥΚ (Julio 2022).


Comentarios:

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