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¿Metabolismo de la bilirrubina e inhibición de UGT1A1 en humanos frente a monos?

¿Metabolismo de la bilirrubina e inhibición de UGT1A1 en humanos frente a monos?


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En humanos, la UGT1A1 parece ser la única enzima relevante para glucuronidar la bilirrubina no conjugada en formas excretadas. ¿Es el camino el mismo para, por ejemplo, el mono Cynomolgus (Macaca fascicularis) in vivo? En caso de que la UGT1A1 se inhiba de forma potente, ¿existe alguna otra enzima potencial para metabolizar / glucuronidar la bilirrubina no conjugada en monos? Además, la bilirrubina es un desafío analítico en los estudios de inhibición de UGT1A1 in vitro. El estradiol (3-glucuronidación) se ha utilizado como sustrato específico para la UGT1A1 humana. ¿Conoce algún sustrato que se sepa que sea específico para el mono UGT1A1? Cualquier referencia sería muy apreciada.


UGT1A1 es común entre la mayoría de los mamíferos que producen bilirrubina (también ratas). No he visto ninguna evidencia que sugiera una vía alternativa en los mamíferos del metabolismo de la bilirrubina. Observe a los pacientes con síndrome de Gilbert (tienen un SNP que es una mutilación que hace que la UGT1A1 sea menos eficiente y, por lo tanto, un aumento de la bilirrubina no conjugada en plasma).

Además, el análisis de bilirrubina de plasma / tejidos es bastante sencillo con los ensayos de HPLC o LCMS. Sin embargo, la inhibición de UGT1A1 in vitro sigue siendo un desafío. Creo que el truco será usar CRISPR para eliminarlo.


Metabolismo de la bilirrubina

El metabolismo normal de la bilirrubina se puede resumir como una serie de pasos, que incluyen (1) producción, (2) captación por el hepatocito, (3) conjugación, (4) excreción en los conductos biliares y (5) entrega al intestino. La ictericia puede resultar de defectos en cualquiera de estos pasos del metabolismo de la bilirrubina.

En los adultos, se producen de 250 a 350 mg de bilirrubina cada día. Aproximadamente del 80% al 85% de esta bilirrubina se deriva de la destrucción de los glóbulos rojos senescentes por el sistema reticuloendotelial. El 15% al ​​20% restante proviene de la descomposición de proteínas distintas de la hemoglobina, como la mioglobina y los citocromos. La figura 7a.1 muestra el metabolismo de la bilirrubina. En las células reticuloendoteliales, la enzima microsomal hemo oxigenasa escinde el hemo en biliverdina. La biliverdina reductasa reduce la biliverdina a bilirrubina antes de ser liberada a la circulación. En esta forma no conjugada, la bilirrubina es insoluble en agua y se transporta al hígado fuertemente unida a la albúmina.

El hígado elimina la bilirrubina no conjugada y otros aniones orgánicos unidos a la albúmina del plasma. Cuando el complejo bilirrubina-albúmina entra en la circulación sinusoidal del hígado, se reconocen tres fases metabólicas distintas: (1) captación de hepatocitos, (2) conjugación y (3) excreción en la bilis. La bilirrubina no conjugada se transporta a través de la membrana sinusoidal del hepatocito hacia el citoplasma. Dentro del hepatocito, la bilirrubina no conjugada está unida por una proteína citoplasmática, en este caso el glutatión. S-transferasa. La enzima microsomal uridina difosfato-glucuronil transferasa luego conjuga la bilirrubina no conjugada insoluble con ácido glucurónico para formar las formas conjugadas solubles en agua, monoglucurónido de bilirrubina (15%) y diglucurónido de bilirrubina (85%). La bilirrubina conjugada se excreta del hepatocito al canalículo biliar mediante un mecanismo de transporte activo.

La excreción en la bilis es el paso que limita la velocidad del metabolismo de la bilirrubina. Después de la excreción, la bilis fluye a través del sistema colector del conducto biliar, puede o no almacenarse en la vesícula biliar y entrar en el duodeno. En el íleon terminal y el colon, las enzimas bacterianas convierten la bilirrubina en urobilinógeno. Del diez al 20% del urobilinógeno se reabsorbe desde el intestino hacia la circulación portal, creando una circulación enterohepática. Este urobilinógeno reciclado puede volver a excretarse en la bilis por el hígado o en la orina por el riñón. El urobilinógeno restante en el intestino se convierte en fecobilinógeno, que le da a las heces su característico color marrón.


Introducción

La obesidad ha alcanzado proporciones epidémicas a nivel mundial y al menos 2,8 millones de personas mueren cada año como resultado del sobrepeso o la obesidad (OMS). La obesidad también representa el factor de riesgo más importante para la resistencia a la insulina, las enfermedades cardiovasculares y la diabetes tipo 2 (DT2) 1. Los pacientes con DM2 son comúnmente hiperglucémicos y sufren complicaciones como hipertensión, ictus, aterosclerosis y cáncer 2. Las estrategias que reducen la obesidad prometen reducir la mortalidad y mejorar la calidad de vida de las personas afectadas.

El tejido adiposo juega un papel fundamental en la homeostasis de la glucosa y el metabolismo de los lípidos 3,4 a través de la producción de diversas proteínas conocidas como adipocinas o adipocitocinas, incluido el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), la interleucina 6, la proteína quimioatrayente de monocitos 1, la leptina y la adiponectina 5. , 6,7. Las adipocinas actúan como interruptores metabólicos, conectando el estado nutricional del cuerpo con otras funciones que consumen energía 8. La desregulación de las adipocinas conduce a enfermedades relacionadas con la obesidad 9. Entre las adipocinas conocidas, los niveles de leptina se corresponden positivamente con la energía almacenada en la masa grasa y los niveles elevados de leptina se correlacionan con un aumento de la adiposidad y la inflamación resultante de una mayor liberación de citocinas, como TNF-α 10. Por el contrario, la adiponectina actúa como un agente sensibilizante a la insulina y mejora la oxidación de los ácidos grasos, la acción de la insulina en el hígado y la captación de glucosa 5,11,12. Los ratones con deficiencia de adiponectina exhiben niveles elevados de glucosa e insulina en plasma después de ser alimentados con una dieta alta en grasas, pero la sobreexpresión de adiponectina en estos ratones por infección adenoviral restaura la sensibilidad a la insulina 13. Además, la adiponectina también tiene efectos antiinflamatorios y antiaterogénicos resultantes de su capacidad para suprimir la activación de NF-κB mediada por TNF-α en las células endoteliales 14. Los niveles de adiponectina circulante aumentan después de la pérdida de peso 15, por inducción de hemo oxigenasa-1 (HO-1) 16 y por tratamiento con ligandos PPARγ, incluidas las tiazolidindionas 17,18.

HO-1 es una enzima limitante que degrada el hemo generando cantidades molares iguales de biliverdina, monóxido de carbono y hierro ferroso 19. La biliverdina se puede convertir rápidamente en bilirrubina por la biliverdina reductasa y el hierro puede regular al alza la ferritina. Se ha demostrado que HO-1 juega un papel fundamental en la reversión de la resistencia a la insulina. Por ejemplo, la inducción de HO-1 sensibiliza la vía de señalización de la insulina en ratas Zucker 20 y en ratones deficientes en leptina (ob / ob), en ratones deficientes en receptores de leptina (db / db) y en ratones obesos inducidos por dieta (DIO) 16,21 , 22,23,24,25,26,27. La bilirrubina imita el efecto de la inducción de HO-1 y mejora la sensibilidad a la insulina en modelos de ratones obesos 28. La bilirrubina es un potente antioxidante con propiedades antiinflamatorias y reguladoras del sistema inmunológico 29. Aunque la bilirrubina anormalmente elevada se ha utilizado como indicador de hepatitis, anemia hemolítica y colestasis, la bilirrubina no conjugada levemente elevada en pacientes con síndrome de Gilbert (1,1 mg / dl a 2,7 mg / dl) se asocia con protección contra aterosclerosis coronaria, enfermedad cardiovascular, como así como otras enfermedades 30,31,32,33. La asociación positiva entre la bilirrubina no conjugada y el hemo plasmático libre, el hierro y la hemoglobina carboxilo en estos pacientes sugiere un circuito de retroalimentación positiva en el que la expresión de HO-1 es inducida por la bilirrubina no conjugada 34.

Hemos demostrado que la administración sistémica de bilirrubina aumenta la sensibilidad a la insulina mediante la supresión del estrés y la inflamación del RE en ratones DIO 35. Ahora hemos ampliado estas observaciones y hemos investigado si la bilirrubina regula el metabolismo de los lípidos como se observa en pacientes con la enfermedad de Gilbert 34 y si la bilirrubina regula los niveles de adipocina en suero en ratones DIO. También evaluamos los efectos a más largo plazo del tratamiento con bilirrubina sobre el metabolismo de los lípidos y los niveles de adipocina 7 semanas después de completar el tratamiento con bilirrubina.


Resultados

Humanizado UGT1 Ratones e hiperbilirrubinemia neonatal.

Eventos celulares y moleculares que subyacen a la regulación de las UGT, especialmente las codificadas por humanos. UGT1 familia de genes, se han estudiado en ratones transgénicos humanizados que expresan la UGT1 locusTgUGT1 ratones) en un Ugt1-null antecedentes (Ugt1 - / - ratones) (Fujiwara et al., 2010). En los humanos, hay nueve UGT1A genes, incluyendo UGT1A1, que están codificados por el UGT1 locus (Clarke et al., 1997 Mackenzie et al., 1997 Gong et al., 2001). Examinar la importancia de lo humano UGT1 locus y el UGT1A1 gen en el control de la bilirrubina sérica, se diseñó una mutación inactivante en el exón 4 del Ugt1a1 gene, generando Ugt1 - / - ratones (Nguyen et al., 2008). Las proteínas UGT1A están codificadas por cinco exones, siendo idéntica la secuencia de codificación de los exones 2-5. Ubicada en el cromosoma 1, la organización de los murinos. Ugt1 el locus está codificado por & gt150 kDa de ADN, con los exones 2-5 ubicados en el extremo 3 'y flanqueados consecutivamente por una serie de nueve exones de casete que codifican la porción N-terminal de cada proteína UGT1A. Por lo tanto, la UGT1 locus en humanos y el Ugt1 locus en ratones codifica nueve funcionales UGT1A proteínas, cada una compuesta por una región N-terminal única codificada por uno de los 5 exones flanqueantes mientras comparten una región C-terminal idéntica codificada por los exones 2-5. Cuando heterocigoto Ugt1 +/− se criaron ratones, descendientes con un Ugt1 - / - Los genotipos nacieron con un llamativo color de piel naranja que resultó de niveles de UCB severamente elevados que se convirtieron en SNH letal entre 4 y 7 días después del nacimiento. Para recuperar la letalidad resultante de la expresión UGT1A1 murina no funcional, TgUGT1 ratones que llevaban y expresaban todo UGT1 locus (Chen et al., 2005) se cruzaron con Ugt1 +/− ratones para generar TgUGT1 / Ugt +/− ratones. Estos fundadores fueron luego retrocruzados para generar TgUGT1 / Ugt1 - / - ratones o humanizados UGT1 (HUGT1) ratones. Expresión de lo humano UGT1A1 gen rescató la letalidad atribuida a SNH en Ugt1 - / - ratones (Fig. 2).

Humanizado UGT1 ratones e hiperbilirrubinemia neonatal. Ugt1 - / - Los ratones se generaron interrumpiendo el exón común 4 con un gen de neomicina, lo que alteraba la función de todo el Ugt1 lugar. Ugt1 - / - Los ratones recién nacidos se identifican fácilmente por su distintivo color naranja de piel, que resulta de la acumulación de bilirrubina no conjugada. La perdida del Ugt1 locus y UGT1A1 de la línea germinal es letal, con todos los Ugt1 - / - ratones que mueren dentro de las 2 semanas posteriores al nacimiento. Cuando cruzamos ratones que llevaban todo el ser humano UGT1 locus genético como un transgén con ratones que llevan el Ugt1-null alelo, humanizado UGT1 ratones (HUGT1) fueron generados. La presencia del humano UGT1A1 gen rescata la letalidad asociada con la ausencia de UGT1A1 murino. Todo recién nacido HUGT1 los ratones desarrollan hiperbilirrubinemia neonatal grave (SNH). Niveles de bilirrubina sérica total (TSB) en HUGT1 los recién nacidos aumentan después del nacimiento, alcanzan niveles máximos aproximadamente 2 semanas después del nacimiento y los niveles vuelven a un rango normal después del destete. La mayoría de HUGT1 los ratones pueden madurar hasta la edad adulta. Aproximadamente el 10% de los recién nacidos HUGT1 los ratones desarrollan convulsiones y mueren. Estos ratones acumulan altas concentraciones de bilirrubina en el tejido cerebral. El desarrollo de SNH se debe a un retraso en la expresión de UGT1A1 en el hígado. La expresión de UGT1A1 en el intestino delgado se asocia con salvar la letalidad de HUGT1 ratones y disminución de los niveles de TSB.

Regulación específica del desarrollo y del tejido del UGT1A genes en HUGT1 Se ha demostrado que los ratones (Chen et al., 2005 Senekeo-Effenberger et al., 2007 Fujiwara et al., 2010 Yueh et al., 2017) reflejan patrones de expresión similares a los caracterizados en tejidos humanos (Strassburg et al., 1997a , b, 1998a, b Tukey y Strassburg, 2000), lo que nos permite aprovechar el uso de HUGT1 ratones en experimentos diseñados para caracterizar los mecanismos que conducen a la expresión específica de tejido, inducible y del desarrollo del ser humano UGT1A genes. Un descubrimiento importante fue el hallazgo de que el ser humano UGT1A1 gen, que está retrasado en el desarrollo en los niños recién nacidos, también está retrasado o reprimido en el desarrollo en HUGT1 ratones recién nacidos (Fujiwara et al., 2012). Dado que UGT1A1 es la única enzima responsable del metabolismo de la bilirrubina sérica, este retraso en el hígado UGT1A1 la expresión génica conduce a SNH en neonatos HUGT1 ratones, con letalidad que afecta al 10% de los recién nacidos, como se muestra por un deterioro motor dramático con movimientos similares a convulsiones. Los cerebros de HUGT1 los ratones que desarrollan convulsiones concentran bilirrubina en los tejidos, lo que se evidencia por un aspecto amarillo intenso o ictérico (Fujiwara et al., 2010). El patrón ictérico no se localiza regionalmente como se encuentra en el globo pálido y el núcleo subtalámico en el tejido cerebral humano, aunque hemos clasificado este fenotipo en neonatal. HUGT1 ratones como kernicterus. El desarrollo máximo de los niveles de TSB en neonatos. HUGT1 los ratones se presentan entre los días 10 y 14 después del nacimiento y disminuyen drásticamente durante los siguientes 5 días. Durante todo el período neonatal, que clasificamos como las primeras 3 semanas después del nacimiento, la expresión de UGT1A1 en el hígado está reprimida. El aclaramiento de TSB en las últimas etapas del período neonatal se corresponde con la inducción del desarrollo de la expresión intestinal de UGT1A1 (Fujiwara et al., 2010) (Fig. 2).

Durante esta fase de desarrollo, la activación dietética o ambiental del UGT1A1 gen e inducción de UGT1A1 en HUGT1 los ratones producen el metabolismo de la bilirrubina y una fuerte disminución de los niveles de TSB. Mapeo de los sitios de unión del receptor nuclear asociados con el UGT1A1 gen ha indicado que la activación transcripcional se puede lograr mediante receptores de esteroides activados de la subfamilia 3 además de los receptores nucleares xenobióticos (XNR) de la subfamilia 1 (Fig. 3). Sugatani y col. (2001) caracterizaron por primera vez el módulo potenciador sensible al fenobarbital (Pb) en el ser humano UGT1A1 gen que se une al receptor activo constitutivo (CAR). Cuando HUGT1 Los ratones recién nacidos se tratan con Pb, se induce el hígado UGT1A1 y los niveles de TSB se reducen drásticamente (Chen et al., 2012 Shibuya et al., 2013 Yoda et al., 2017 Yueh et al., 2017). Sin embargo, en hUGT1 / Coche - / - ratones, la administración de Pb no induce UGT1A1 y no tiene impacto en los niveles neonatales de TSB, lo que confirma genéticamente que CAR regula la UGT1A1 gene. En HUGT1 ratones, el UGT1A1 El gen puede ser inducido transcripcionalmente por otros XNR, incluido el receptor X de pregnano (PXR) (Chen et al., 2012), el receptor alfa activado por proliferador de peroxisoma (PPARα) (Senekeo-Effenberger et al., 2007), los receptores X del hígado alfa y beta (LXRα/β observaciones no publicadas), y los sensores ambientales, el receptor de hidrocarburos arilo (AhR) (Yueh et al., 2003 Chen et al., 2005 Bonzo et al., 2007), y Nrf2 (Yueh y Tukey, 2007 Yoda et al., 2017). La administración oral o intraperitoneal de ligandos capaces de activar estos receptores en neonatos. HUGT1 ratones conduce a la inducción de UGT1A1 hepático o intestinal seguido de reducciones en los niveles de TSB. La reducción de los niveles de TSB al principio de la ventana neonatal asegura que los ratones eviten la disfunción neurológica inducida por bilirrubina (Fig. 3).

Activación, represión y desrepresión mediada por receptores nucleares (NR) de UGT1A1 gen y el impacto sobre la hiperbilirrubinemia en HUGT1 ratones. Elementos de unión de varios NR, incluido PPARα, AhR, Nrf2, CAR, PXR y LXRα, se han identificado en la región promotora aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción del UGT1A1 gene. Tras la unión del ligando, estos NR pueden reclutar coactivadores e iniciar aguas abajo UGT1A1 la expresion genica. Cuando HUGT1 los recién nacidos fueron expuestos a diferentes agonistas de NR, se observaron niveles reducidos de bilirrubina sérica (excepto PPARγ). En ausencia de ligando, algunos NR se asocian con correpresores NR (como NCoR1 y SMRT) y reclutan enzimas HDAC modificadoras de cromatina para formar un complejo represivo y limitar la activación transcripcional. La interrupción del complejo represivo puede conducir a la desrepresión de la expresión génica. Humanizado UGT1 ratones deficientes en PXR (ABRAZO / Pxr - / - y hUGT1 / Pxr - / - / Coche - / - ), pero no CAR (hUGT1 / Coche - / - ), se asocian con una reducción de la bilirrubina sérica total. Cuando se silencia selectivamente, los correpresores SMRT, NCoR1 o HDAC en los hepatocitos primarios aislados de HUGT1 ratones, UGT1A1 se observó activación genética.

PXR es un objetivo de esteroides, una proteína represora y un regulador de UGT1A1.

La importancia de la PXR como regulador del control endocrino, el metabolismo de los fármacos y la hiperbilirrubinemia comenzó a surgir cuando predijimos que la PXR controlaba el metabolismo de los fármacos dirigido por UGT durante la gestación. Por ejemplo, los niveles de TSB circulante son más bajos en las mujeres durante el embarazo, lo que indica que el metabolismo de la bilirrubina se acelera a través de la UGT1A1 inducida (Bacq et al., 1996). El labetalol, un fármaco antihipertensivo que es metabolizado principalmente por UGT1A1, muestra un mayor aclaramiento en el segundo y tercer trimestre del embarazo en comparación con el período posparto (Jeong et al., 2008). El embarazo produce aumentos bruscos de hormonas durante el desarrollo gestacional, con aumentos de esteroides como estrógenos, progestágenos y glucocorticoides. Dado que se había predicho que la PXR serviría como un objetivo endógeno de baja afinidad para los grupos de esteroides circulantes que eventualmente resultarían en cambios fisiológicos como el metabolismo de los fármacos (Blumberg et al., 1998), examinamos el impacto de la PXR en el control de la UGT1A genes durante el embarazo en ABRAZO1 * 1 y HUGT1 * 28 ratones (Fujiwara et al., 2010). Adulto HUGT1 * 28 Los ratones son hiperbilirrubinémicos, con niveles de TSB que promedian 1 mg / dl en comparación con niveles indetectables en HUGT1 * 1 ratones. Durante el embarazo y la gestación tardía, los niveles de TSB en HUGT1 * 28 los ratones promediaron 0,4 mg / dl, más de un 50% menos que en ratones no embarazadas. Durante el final de la gestación, las proteínas UGT1A se inducen en el hígado. La activación de PXR también se documentó mediante análisis CHIP, lo que demuestra una mayor unión de PXR asociada con el UGT1A1 gen durante la última etapa del embarazo (Chen et al., 2012). Para examinar el papel de PXR como modulador del metabolismo de fármacos, cruzamos ABRAZO1 * 1 ratones con Pxr - / - ratones y examinó la expresión de la UGT1 locus en embarazadas hUGT1 / Pxr - / - ratones. En comparación con HUGT1 ratones, UGT1A1, -1A3, -1A4, -1A6, y -1A9 expresión genética en hUGT1 / Pxr - / - los ratones se reducen considerablemente durante las últimas etapas de la gestación. Cuando se administró el glucocorticoide dexametasona (DEX) a HUGT1 ratones, cada uno de los cinco UGT1A se indujo genes expresados ​​en el hígado. Aunque se demostró previamente que la activación del receptor de glucocorticoides por DEX activa UGT1A1 construcciones de genes informadores, DEX no tuvo ningún efecto sobre la inducción de UGT1A1 en hUGT1 / Pxr - / - ratones, lo que indica que la inducción de la UGT1A genes por glucocorticoides se facilita únicamente mediante la activación de PXR in vivo.

Silenciamiento transcripcional del UGT1A1 Gene.

En experimentos de cría para crear hUGT1 / Pxr - / - ratones, análisis de los niveles de TSB en neonatos HUGT1 y hUGT1 / Pxr - / - los ratones demostraron que PXR juega un papel clave en el control de los niveles de TSB durante el desarrollo. En neonatal hUGT1 / Pxr - / - ratones, el hígado UGT1A1 se induce cuando se compara con su expresión en HUGT1 ratones (Chen et al., 2012). El aumento de los niveles de UGT1A1 en el hígado en hUGT1 / Pxr - / - los ratones conducen a niveles reducidos de TSB. Este hallazgo sugiere que en ausencia de ligando endógeno, el papel fisiológico de PXR conduce a la represión de la UGT1A1 gen durante el desarrollo temprano. Más importante aún, bloquear la activación del UGT1A1 El gen por PXR se controla en el hígado a través de procesos de desarrollo neonatal, ya que su deleción en adultos hUGT1 / Pxr - / - los ratones no tienen impacto en UGT1A1 expresión génica, excepto en ratones preñados. Por tanto, PXR participa en el silenciamiento transcripcional del UGT1A1 gen (Fig. 3).

En combinación con los receptores nucleares, el silenciamiento transcripcional o la represión se logra en gran medida con dos correpresores represores nucleares prototípicos, el mediador silenciador del receptor de la hormona retinoide y tiroidea (SMRT) y el correpresor del receptor nuclear 1 (NCoR1) (Francis et al., 2003) Mottis et al., 2013), lo que sugiere que NCoR1 y / o SMRT participan en el control de la expresión de UGT1A1 durante el desarrollo. Mecánicamente, las proteínas correpresoras interactúan con XNR, como RXR, LXR, PPAR y PXR, para controlar colectivamente los patrones de expresión génica mediante el reclutamiento de enzimas modificadoras de cromatina que limitan la accesibilidad del ADN nucleosómico y la activación transcripcional. En ausencia del receptor nuclear o del correpresor, los coactivadores adicionales cooperan con un conjunto diferente de enzimas modificadoras de la cromatina para promover la activación transcripcional. En experimentos destinados a eliminar NCoR1 / SMRT en varios tejidos o líneas celulares, la eliminación del correpresor conduce espontáneamente a la activación no ligando de los XNR, lo que facilita la activación transcripcional de los genes diana de XNR (Li et al., 2013). A menudo, la activación transcripcional de genes diana cadena abajo por XNR activados espontáneamente proporciona una firma genómica que puede usarse para identificar el XNR exacto involucrado en la respuesta. Para determinar si NCoR1 y SMRT están involucrados en la represión del UGT1A1 gen en el hígado, eliminación de NCoR1 y SMRT en neonatos primarios HUGT1 hepatocitos por siRNA conduce a la desrepresión de UGT1A1 (Chen et al., 2017). Se observaron efectos similares después de la ablación de HDAC1 o HDAC3, lo que indica que NCoR1 y SMRT están implicados junto con HDAC1 / HDAC3 en la represión de la expresión de UGT1A1 la expresion genica. Si bien la eliminación de genes en cultivo de tejidos es una herramienta eficaz para identificar eventos reguladores potenciales, la eliminación de genes específica de tejido dirigido in vivo proporciona evidencia adicional del impacto bioquímico y fisiológico de su papel en la homeostasis normal. Con evidencia de que PXR junto con NCoR1 y SMRT está relacionado con la represión neonatal de la expresión de UGT1A1 en el hígado, se iniciaron experimentos utilizando la deleción condicional de NCoR1 para examinar los mecanismos moleculares que vinculan el desarrollo neonatal con el hígado y el intestino. UGT1A1 expresión génica (Fig. 3).

Un papel importante para NCoR1 en la regulación UGT1A1 Ha surgido la expresión génica en recién nacidos (Chen et al., 2017). Generamos floxed Ncor1 ratones bajo un HUGT1 antecedentes (TgUGT1 /Ugt1 - / - /nortecor1 F / F ), denominados ratones F / F UN, y luego eliminaron aún más NCoR1 en el hígado (ΔHEP ONU ratones) y tejido intestinal (ΔIEC UN ratones) de HUGT1 ratones. Cuando se examinaron los niveles de TSB en ratones recién nacidos, el tipo salvaje F / F UN y ΔHEP ONU Los ratones exhibieron patrones similares de hiperbilirrubinemia neonatal como se observó en HUGT1 ratones. La deleción de NCoR1 en el tejido hepático no tuvo ningún impacto en el hígado. UGT1A1 la expresion genica. Sorprendentemente, después de la deleción intestinal específica de NCoR1, el desarrollo de hiperbilirrubinemia neonatal disminuyó por completo en ΔIEC UN ratones. El impacto de la supresión de NCoR1 intestinal condujo a la desrepresión de la expresión de UGT1A1 intestinal con una inducción significativa de proteína que se produce tanto en el eje longitudinal [es decir, todas las secciones del intestino delgado (SI)] como en el eje cripta-vellosidad. Mecánicamente, la desrepresión o inducción de UGT1A1 después de la desactivación de NCoR1 se observó solo durante el desarrollo neonatal, ya que la desrepresión de UGT1A1 no ocurrió en adultos ΔIEC UN ratones. Esta interesante observación indica que NCoR1 juega un papel clave como proteína correpresora en procesos importantes para el desarrollo relacionados con la homeostasis intestinal. Estos procesos pueden estar directa o indirectamente relacionados con la desrepresión de la UGT1A1 gen (Fig. 4).

NCoR1 reprime humanos UGT1 expresión génica durante el desarrollo. NCoR1 F / F los ratones se cruzaron en HUGT1 para generar F / F UN ratones, que a su vez se cruzaron con ratones que llevaban Cre recombinasa y eliminaron NCoR1 específicamente en el hígado (ΔHEP ONU ) y tejido intestinal (ΔIEC UN ). Se examinaron los niveles de bilirrubina sérica en ratones recién nacidos, ΔHEP ONU Los ratones exhibieron un patrón similar de hiperbilirrubinemia neonatal como HUGT1 (F / F UN ) ratones, pero este patrón disminuyó por completo con la desactivación de NCoR1 en el tracto intestinal de ΔIEC UN ratones. El cambio de la acumulación de bilirrubina también se evidenció en los tejidos grasos. Inducción de UGT1A1 intestinal en ΔIEC UN Se observó a los ratones y fue más prominente durante la etapa de desarrollo, pero no ocurrió después del destete o en la edad adulta. Los datos se expresan como media ± SEM, **pag& lt0.01, ***pag& lt0.001, ****pag& lt0.0001, prueba t de Student. Análisis ANOVA bidireccional para ΔIEC UN vs F / F UN (pag& lt0.0001).

Cuando realizamos el perfil transcripcional del tejido intestinal mediante la implementación del análisis de RNA-seq de F / F UN y ΔIEC UN ratones, el análisis de ontología genética identificó la vía metabólica como la vía más significativamente alterada en ΔIEC UN ratones, seguida de fosforilación oxidativa y metabolismo de fármacos. La eliminación de la expresión de PPAR promovida por NCoR1α y LXRα genes diana, lo que indica que NCoR1 está acoplado a estos genes durante el desarrollo neonatal. La deleción de NCoR1 tuvo un gran impacto en el metabolismo de los ácidos grasos y la energía, además del metabolismo de los lípidos y el colesterol. Los niveles de ARN mensajero de los genes del ciclo de TCA y los genes de fosforilación oxidativa aumentaron de manera coordinada. Estas vías metabólicas aceleradas indicaron que NCoR1 reprimía vías clave esenciales para la maduración y síntesis de células epiteliales. En ΔIEC UN En ratones recién nacidos, la longitud media del intestino delgado era un 8% más larga y un 15% más pesada que en F / F UN compañeros de camada, lo que indica un aumento de la proliferación intestinal. Los hallazgos de histología y microscopía electrónica indicaron un borde en cepillo y microvellosidades muy maduros en ΔIEC UN . Cuando examinamos las señales de proliferación celular, la inmunotinción de Ki-67, un marcador celular para la proliferación, aumentó en ambos ΔIEC UN duodeno y yeyuno. En apoyo de este hallazgo, la tinción con bromodesoxiuridina, utilizada para detectar células en proliferación, mostró un aumento progresivo de células epiteliales positivas. Estos hallazgos demostraron que la deleción de NCoR1 fue el catalizador para acelerar la proliferación celular y promover la proliferación de células epiteliales. En apoyo de la proliferación celular, la regulación positiva de la maduración intestinal La sacarasa isomaltasa, una glucosidasa del borde en cepillo que solo existe en el tejido intestinal diferenciado y es un marcador de la maduración de los enterocitos, se indujo significativamente en ΔIEC UN ratones, junto con otros marcadores de maduración que incluían el duodeno específico Akp3 gen y el yeyuno específico Krt20 gene. Estos estudios confirmaron que la expresión de NCoR1 neonatal sirve para reprimir la expresión génica, incluida la UGT1A1, mientras controla mecánicamente los cambios de desarrollo subyacentes a la maduración intestinal desde la etapa neonatal hasta el tejido adulto.

NCoR1 Regulación y expresión de UGT1A1 intestinal.

El NCoR1 intestinal puede ser la pieza central en el control del metabolismo de la bilirrubina en las células epiteliales intestinales (IEC) durante la ventana neonatal. La capacidad funcional de NCoR1 para promover sus propiedades represivas con receptores nucleares, así como su potencial para activar la transcripción de genes, se han relacionado con eventos de fosforilación (Mottis et al., 2013 Jo et al., 2015), controlados por varias quinasas diferentes. (Fernández-Majada et al., 2007 Huang et al., 2009 Choi et al., 2013). Por ejemplo, la pérdida de NCoR1 nuclear en el melanoma maligno se asoció con la fosforilación dependiente de IKK de residuos de serina NCoR1 específicos (Gallardo et al., 2015). Cuando se fosforila NCoR1, se disocia de la cromatina y migra al citoplasma, un movimiento que estimula los eventos de desrepresión transcripcional. Los hallazgos de nuestros estudios también han establecido estrechos vínculos entre la activación de IKK, la función NCoR1 y las reducciones en los niveles de TSB en HUGT1 ratones (Chen et al., 2017). IKK intestinalβ es fundamental para controlar el metabolismo basal de la bilirrubina dependiente de UGT1A1. Cuando IKKβ se elimina en IEC en HUGT1 ratones (hUGT1 / Ikkβ ΔIEC ratones), la expresión basal de UGT1A1 intestinal en ratones recién nacidos desciende, lo que lleva a elevaciones en los niveles de TSB que son letales (Liu et al., 2016). Cuando se desfosforila NCoR1, como existe potencialmente cuando IKKβ se elimina, planteamos la hipótesis de que el complejo NCoR1 / NR aprieta su unión a la cromatina para mejorar la represión transcripcional, como se observa por una mayor reducción en la expresión de IEC de UGT1A1. Esta hipótesis fue probada sobreexpresando IKK activoβ en IEC, un evento que llevó a la desrepresión de los genes de maduración intestinal, como las respuestas mencionadas anteriormente que documentamos cuando se eliminó NCoR1 (Chen et al., 2017). La capacidad de IKK activada constitutivamenteβ para imitar las acciones de la deleción de NCoR1 también se demostró cuando HUGT1 Los ratones recién nacidos se trataron por vía oral con cadmio (Cd 2+), que actúa como un potente inductor del estrés oxidativo y un activador de la IKK.β (NF) -κVía B (Liu et al., 2016). El tratamiento con cadmio resultó en la inducción intestinal de UGT1A1, una fuerte reducción en los niveles de TSB y la inducción de genes de maduración intestinal, eventos que se observan cuando se elimina NCoR1. La inducción de UGT1A1 intestinal dependiente de Cd 2+ podría ser impulsada por la activación de IKK, a través de la cual puede contribuir directamente, o mediante mecanismos alternativos, a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Curiosamente, ambos procesos podrían desempeñar un papel en la focalización de la fosforilación de NCoR1, un evento que daría lugar a la activación del intestino. UGT1A1 gene.

Estrés oxidativo y regulación de UGT1A1.

Conociendo esa expresión constitutiva de la IKK intestinalβ es fundamental para mantener niveles adecuados de expresión de la UGT1A1 gen, muy probablemente a través de la activación y modificación de NCoR1, examinamos el impacto del estrés oxidativo intestinal hacia la inducción de UGT1A1. El fundamento de este experimento surgió de los hallazgos de que el IKKβ/ NF-κLa vía B responde a cambios redox, como alteraciones en ROS. Para realizar este experimento y eliminar el papel de IKKβ, HUGT1 y hUGT1 / Ikkβ ΔIEC los ratones fueron tratados por vía oral con Cd 2+ o arsénico (As 3+), ambos conocidos por inducir un estrés oxidativo significativo (Santra et al., 2000 Ercal et al., 2001 Li et al., 2002 Liu et al., 2003 López et al., 2006). Sin tratar hUGT1 / Ikkβ ΔIEC los ratones mostraron una expresión intestinal reducida de UGT1A1 y niveles elevados de TSB, y la mayoría de los ratones murieron de SNH (Liu et al., 2016). Cuando es neonatal HUGT1 los ratones se trataron por vía oral con Cd 2+ o As 3+, se indujo UGT1A1 intestinal y se redujeron los niveles de TSB (Liu et al., 2016 Yoda et al., 2017). Asimismo, cuando hUGT1 / Ikkβ ΔIEC los ratones fueron tratados con Cd 2+ o As 3+, se indujo estrés oxidativo en los intestinos, acorde con la inducción de UGT1A1 y una disminución de los niveles de TSB. Mientras es neonatal no tratado hUGT1 / Ikkβ ΔIEC los ratones acumularon niveles tóxicos de TSB que fueron letales, el tratamiento oral con Cd 2+ o As 3+ condujo a la inducción de UGT1A1 intestinal y a la disminución de los niveles de TSB (Fujiwara et al., 2012 Liu et al., 2016). El arsénico, un inductor del estrés oxidativo, conduce a la activación rápida de la proteína quinasa activada por mitógeno p38 (Yoda et al., 2017) y la quinasa regulada por señales extracelulares, ambos sensores de estrés oxidativo. Curiosamente, el tratamiento oral con As 3+ confirmó que también se indujeron genes marcadores de maduración de IEC. Además, la expresión de Glb1, Nox4, y Lrp2 genes, que están regulados a la baja en la transición del amamantamiento al destete, se redujo, imitando el mismo patrón observado en ΔIEC UN ratones. La activación de MAPK y quinasa regulada por señales extracelulares por As 3+ puede estimular la actividad de quinasa en las IEC, promoviendo la desrepresión de la expresión génica de una manera dependiente de NCoR1.

Una suposición preventiva de estrés oxidativo en tejidos y células es la existencia o evolución de un potente sistema de defensa para contrarrestar las posibles toxicidades asociadas con la generación de ROS. The formation of oxidative stress, induced by natural diet or through environmental exposure, sets into motion a unique signaling cascade that activates gene families that regulate cytoprotective proteins to provide an active defense against cellular damage. The central mediator of this defense is the nuclear E2-factor related factor 2 (Nrf2), which exists as an Nrf2-Keap1 complex that is sensitive to ROS (Wasserman and Fahl, 1997). Activation of Nrf2 sets into motion transcriptional activation of target genes following binding to unique enhancer sequences identified as antioxidant response elements (AREs) (Wasserman and Fahl, 1997 Nguyen et al., 2000). The ARE sequences are clustered with the AhR xenobiotic response element flanking the UGT1A1 gene and bind activated Nrf2 (Yueh and Tukey, 2007). The antioxidant response can target the UGT1A1 gene, in addition to other genes responsive to ROS, such as NAD(P)H:quinine oxidoreductase 1 (McWalter et al., 2004), glutathione-S-transferase, and heme oxygenase (Alam et al., 1999). Thus induction of these genes following oxidative stress provides a molecular footprint that can be leveraged to identify substances that activate the Nrf2-Keap1 complex in providing antioxidant protection.

CAR, Oxidative Stress, and UGT1A1.

Some of the more potent inducers of oxidative stress are the isothiocyanates (ITCs). Regarded as an important component of our diet, cruciferous vegetables (i.e., broccoli, Brussels sprouts, cauliflower, watercress) have been linked to a lower incidence of cancer development (Murillo and Mehta, 2001) because they produce antioxidative metabolites that induce cytoprotective proteins, such as the UGTs, believed to protect tissue from dietary or environmental toxicity such as cancer. These vegetables are rich in glucosinolates, which are hydrolyzed by plant myrosinases following chewing or by microflora in the gastrointestinal tract to form ITCs (Shapiro et al., 2001a,b, 2006), the active anticarcinogenic metabolites. Isothiocyanates activate the Nrf2-Keap1 complex, initiating a series of events leading to induction of ARE containing target genes (Nguyen et al., 2003). We rationalized that ITC treatment would induce intestinal and potentially liver UGT1A1 in hUGT1 mice and serve as an efficient modulator of neonatal hyperbilirubinemia by inducing UGT1A1 and lowering TSB levels. When neonatal hUGT1 mice were treated orally with phenethyl isothiocyanate (PEITC), TSB levels were reduced to normal after 24 hours (Yoda et al., 2017). Induction of UGT1A1 was dramatic in both liver and small intestines, but the impact on the classic Nrf2-target genes Nqo1 y Gsta1/2 was not significant. We showed previously that oral As 3+ , which generates a potent antioxidant response, has a dramatic impact on Gsta1 y Gsta2 induction while also upregulating several of the cytochrome P450 2 and 4 subfamilies (Liu et al., 2016), indicating that the antioxidant response potentially initiated by PEITC treatment could be influencing the activation of additional signaling pathways. A screen of potential target genes induced by XNRs resulted in prominent induction of Cyp2b10/CYP2B10 in both liver and SI, indicating that CAR may be involved in the PEITC induction of UGT1A1 (Fig. 5).

PEITC regulates UGT1A1 gene expression through ROS-mediated nuclear receptor signaling. Consumption of cruciferous vegetables leads to the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS activates Nrf2 nuclear translocation, thus facilitating Nrf2-antioxidant response element (ARE) signaling and the transcriptional activation of the susceptible target genes. In addition, ROS are linked to the activation of CAR in both liver and small intestines, which results in the induction of Cyp2b10 and UGT1A1. The addition of norte-acetylcysteine (NAC) blocks ROS production, nullifying both CAR and Nrf2 activation.

To examine the component of CAR linking induction of UGT1A1 and CYP2B10 by PEITC, hUGT1/Car −/− were bred to generate CAR knockout hUGT1/Car −/− and heterozygous hUGT1/Car −/+ littermates. Ambos hUGT1/Car −/− y hUGT1/Car +/− neonatal mice develop hyperbilirubinemia at the same rate. When treated with an oral dose of PEITC, UGT1A1 and CYP2B10 were induced in liver and SI of hUGT1/Car +/− mice, with a total reduction in TSB levels. The induction of hepatic UGT1A1 was significant and most likely drove the metabolism of bilirubin, leading to the reduction in TSB levels. In liver tissue from PEITC-treated hUGT1/Car −/− mice, there was no expression of CYP2B10 or UGT1A1, indicating that CAR was essential for induction by PEITC. In SI, the induction of CYP2B10 was also absent, yet TSB levels were significantly reduced. In the absence of CAR, there was induction of UGT1A1 in the SI, which we expect was responsible for the reduction in TSB levels. While the induction by PEITC in SI could be attributed to activation of Nrf2, there was no significant transcriptional activation of other ARE target genes. The possibility exists that PEITC induction of intestinal UGT1A1 in neonatal mice is being driven by a mechanism that is independent from CAR and Nrf2 activation (Fig. 5).

Confirmation that CAR underlies CYP2B10 and UGT1A1 induction by PEITC was validated in adult hUGT1/Car +/− y hUGT1/Car −/− ratones. In liver and SI, oral PEITC treatment induced CYP2B10 in a strictly CAR-dependent fashion. Significant induction of CYP2B10 by PEITC in these tissues was generated only in hUGT1/Car +/− mice, with no response in hUGT1/Car −/− mice in either tissue, leaving us to speculate that induction of CYP2B10 by PEITC involved activation of CAR. A different pattern of induction was observed with UGT1A1 expression. In liver, UGT1A1 expression was greatly reduced in hUGT1/Car −/− mice, clearly linking CAR activation with UGT1A1 expression. However, in SI, PEITC treatment effectively induced UGT1A1 in both hUGT1/Car +/− y hUGT1/Car −/− mice, indicating that alternative CAR processes, such as activation of Nrf2, are responsible for the induction. In addition, Nrf2 target genes were induced in both liver and SI, confirming that the actions of PEITC are also initiating an ARE response. These findings indicate that two important signaling events, the activation of CAR and Nrf2, are linked to induction of UGT1A1 (Fig. 5).

Independently, the activation of CAR by ligands or the activation of Nrf2 by oxidative stress can facilitate the induction of UGT1A1. However, with PEITC treatment, evidence suggests that CAR and Nrf2 are linked in the induction of liver UGT1A1. To separate an antioxidative response initiated by PEITC from activation of CAR and induction of UGT1A1, we first administered adult hUGT1 ratones norte-acetylcysteine (NAC) for 3 weeks in their drinking water. Cysteine is the rate-limiting substrate for the synthesis of glutathione (GSH), and thus supplementation of NAC promotes the resynthesis of GSH and the neutralization of free radicals (Rizzardini et al., 1994). GSH has antioxidant properties in addition to facilitating the activity of enzymatic antioxidant systems, including GSH peroxidase and GSH reductase. After 2 weeks of NAC exposure, the mice were treated with PEITC, and antioxidant responses were measured. In the absence of NAC exposure, PEITC treatment leads to robust induction of Nrf2 target genes Nqo1, Gsta1, y Gsta2, junto con UGT1A1 y Cyp2b10. In mice exposed to NAC and treated with PEITC, Cyp2b10 gene expression was completely suppressed, along with Nqo1, Gsta1, y Gsta2. While PEITC induces oxidative stress that targets Nrf2 target genes, induction of UGT1A1 and CYP2B10 is dependent upon CAR. These findings indicate that induction of liver UGT1A1 by PEITC is dependent upon both Nrf2 and CAR, while the generation of oxidative stress is a prerequisite toward CAR activation and induction of UGT1A1 and CYP2B10 (Fig. 5).

Breast Milk-Induced Hyperbilirubinemia.

Breast milk (BM) plays a significant role in neonatal hyperbilirubinemia (Newman and Gross, 1963 Fujiwara et al., 2015), termed breast milk jaundice (BMJ) and is characterized by prolonged increases in unconjugated bilirubin. Infants with BMJ have elevated TSB levels above 10 mg/dl that can reach levels above 20 mg/dl, approaching the range that can induce bilirubin-induced neurologic toxicities. The prolonged increases in TSB levels during the neonatal window in hUGT1 mice indicate that breast milk may be participating in the development of hyperbilirubinemia. When neonatal hUGT1 mice were fed human breast milk, the mice continued to develop jaundice (Fujiwara et al., 2012). Clinical studies have demonstrated that newborns with jaundice given a formula diet have lower levels of TSB than breast-fed newborns, indicating that breast milk facilitates the repression of UGT1A1 (Schneider, 1986 Huang et al., 2004). To examine if we could replicate this effect in hUGT1 mice, neonatal mice were given a diet of baby formula for 72 hours (Fujiwara et al., 2012). After formula treatment, TSB levels were reduced over 95% compared with breast-fed mice. Formula induced UGT1A1 in intestinal tissue, which correlated with the reductions in TSB levels. Of significance, formula also induced the CAR target gene Cyp2b10 and PXR target gene Cyp3a11, indicating that formula targeted activation of CAR and PXR. When formula was given to neonatal hUGT1/Car −/− o hUGT1/Pxr −/− mice, intestinal UGT1A1, Cyp2b10, and Cyp3a11 were induced in both strains, indicating formula was not activating either CAR or PXR. However, formula feeding led to activation of IκB/NF-κB target genes, linking activation of NF-κB with induction of intestinal UGT1A1. Given the finding that formula leads to activation of NF-κB and induction of intestinal UGT1A1 in neonatal hUGT1 mice, it can be speculated that the repressive effects of BM are tied with inhibition of the IKK/NF-κB pathway.

While IκB kinase (IKK) is an upstream component of NF-κB signaling, it is linked to propagating the cellular response to inflammation (Karin, 2009) and plays an important role in neonatal intestinal UGT1A1 expression (Fujiwara et al., 2012). Human breast milk, especially colostrum, is rich in human milk oligosaccharides (HMOs) (Bode, 2015 Lin et al., 2017) that bind to Toll-like receptors (TLRs) and prevent activation of the receptors by pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), which are expressed by microflora (He et al., 2016a Newburg et al., 2016). When TLRs are activated, they initiate intracellular signaling events that result in regulation of IKK and NF-κB. In comparison with term babies and adults, preterm children express higher concentrations of TLRs, and if activated, could induce an IKK/NF-κB inflammatory response that results in sepsis or necrotizing enterocolitis (NEC) (He et al., 2016a,b Niño et al., 2016). Components of breast milk block intestinal TLR activation by PAMPs, which in turn blocks downstream IKK phosphorylation. Since we have demonstrated that targeted deletion of intestinal IKKβ en hUGT1 mice represses newborn intestinal UGT1A1, we can speculate that IKK activity is directly linked to intestinal UGT1A1 expression. This concept is further supported by findings that when intestinal TLRs are activated in neonatal hUGT1 mice by agents, such as LPS, or IKK is directly activated by Cd 2+ , intestinal UGT1A1 is induced followed by a reduction in TSB levels. Thus the delayed expression of intestinal UGT1A1 can be traced to breast milk inhibition of TLR activation, which controls downstream activation of IKK. This concept can be highly relevant toward understanding the underlying mechanism associated with BMJ, since NCoR1 activity controls intestinal maturation and is directly linked to induction of intestinal UGT1A1. This also may explain why a diet of formula, which lacks TLR binding glycans, allows downstream activation of the IKK/NCoR1 loop, induction of intestinal UGT1A1, and a reduction in TSB levels. Equation would naturally dilute the concentrations of the TLR binding glycans allowing activation of the TLRs by PAMPs, followed by derepression of NCoR1 and induction of intestinal UGT1A1.


Principios generales

1.07.4.2 Glucuronosyl Transferases

Glucuronosyl transferases are a family of enzymes that catalyze the transfer of glucuronic acid from uridine diphosphate (UDP)-glucuronic acid to acceptor molecules containing hydroxyl, phenol, carboxylic acid, thiol, or amine groups ( Mulder 1992 Tukey and Strassburg 2000 ). Kinetic studies have shown that these enzymes follow a random sequential mechanism. Glucuronosyl transferases are located in the endoplasmic reticulum, and their biosynthesis can be induced by a number of drugs and xenobiotics. Some forms of glucuronosyl transferases are coordinately induced with cytochromes P450. Conjugation with glucuronic acid makes lipophilic molecules much more water-soluble and readily excretable, and therefore is considered a detoxication pathway. However, acyl glucuronides can undergo structural rearrangements and react with nucleophilic groups in cells ( Faed 1984 Ritter 2000 ). Thus glucuronidation of some molecules may represent bioactivation. For example, the acyl glucuronide of the hypolipidemic drug clofibrate acylates cellular macromolecules ( Faed 1984 ). However, the toxicological significance of this reaction is unclear.


UGT1A6

Common UGT1A6 Polymorphisms

UGT1A6 is a phenol-metabolizing UGT, primarily involved in the glucuronidation of simple phenols and planar arylamines 5,93 that mediates the conjugation of many currently prescribed drugs including antidepressants, neuroleptics and β-adrenoreceptor blockers. 93,129,130,131,132,133,134 The UGT1A6 gene has been found to be polymorphic with at least four alleles characterized by three SNPs in the coding sequence. The unmodified ‘wild-type’ allele is referred to as UGT1A6 * 1, while the allele characterized by the presence of both missense polymorphisms at codons 181 (Thr 181 Ala) and 184 (Arg 184 Ser) is referred as UGT1A6 * 2. 130 Although these two mutations are usually linked, both mutations have been observed separately. A single mutation at codon 184 is designated UGT1A6 * 3 and a single mutation at codon 181 is designated UGT1A6 * 4 (Table 4). 130,135 Functional studies by Ciotti et al 130 revealed that the protein encoded by the UGT1A6 * 2 allele has lower activity towards several phenolic compounds (27–75% of the rate of the wild-type enzyme). Also, 3-O-methyl-dopa and methyl salicylate were conjugated at 41–74% of the wild-type rate, whereas a series of β-blockers were metabolized at 28–69% of the normal level. The clinical implications of these variant alleles still remain to be determined. The data reported by Ciotti et al 130 has suggested that the UGT1A6 * 2 low-activity allele is frequent in the population (frequency of 0.173). The impact of single substitutions at codons 181 ( * 4) and 184 ( * 3) was not assessed in vitro. The allelic distribution as a function of ethnicity was further assessed in a second study conducted by Lampe et al. 135 They reported higher frequencies of the UGT1A6 * 2 and UGT1A6 * 3 alleles compared to previous studies, with distributions being slightly different between Caucasian and Asian populations (Table 4). In a population composed of healthy Caucasian subjects (norte=103), frequencies of 0.010 and 0.024 were observed for the alleles UGT1A6 * 3 and UGT1A6 * 4 and the genotype frequencies were found to be in Hardy–Weinberg equilibrium (Table 4).

The combined distribution of polymorphisms in the TATA-box region of the UGT1A1 promoter and polymorphisms in UGT1A6 was assessed in the study of Lampe et al. 135 A significant linkage disequilibrium between genotypes for UGT1A1 * 28 and UGT1A6 * 2 was observed in both Caucasian and Asian populations. Homozygous variants were observed in 8% of the cases and 43% of individuals had at least one variant allele for both UGT1A1 * 28 and UGT1A6 * 2. Therefore, for compounds metabolized by these two hepatic UGT enzymes, neither of them would theoretically be able to compensate for the deficiency of the other enzyme since low-activity UGT1A6 and UGT1A1 alleles are closely linked.

Modulation of Colon Adenoma Risk by UGT1A6 Genotypes

The group of Bigler et al 136 have explored the role of UGT1A6 polymorphic variations in relation to the risk of developing colon adenoma. In their population-based study, 474 adenoma cases and 563 control subjects were genotyped for the variations at codons 181 and 184 of UGT1A6. Regression analyses, adjusted for age, sex, smoking and hormone replacement therapy, did not reveal any significant increase in the risk of developing adenoma in subjects carrying variant UGT1A6 alleles. However, the UGT1A6 genotype was shown to modulate colon adenoma risk in aspirin users (OR=0.53 (95% CI=0.33–0.86)) and nonaspirin NSAID users (OR=0.47 (95% CI=0.24–0.92)) when compared to aspirin and nonaspirin NSAID users carrying the UGT1A6 wild-type genotype, respectively. These results suggest that the UGT genotype modulates the efficacy of chemopreventive drugs, such as NSAID.


Neonatal Jaundice

Fisiopatología

Kernicterus, which is characterized by a deposition of unconjugated bilirubin in brain cells, may occur in neonates as the result of hyperbilirubinemia and the immaturity of the blood-brain barrier. Unconjugated bilirubin is the major breakdown product of heme and is normally glucuronidated in liver . Bilirubin diglucuronide is excreted in feces by way of the bile. When this process is altered, the unconjugated bilirubin may be deposited in the basal ganglia, hippocampus and hypothalamic nuclei as bilirubin-phosphatidylcholine precipitate, where it gives rise to neuronal necrosis. Clinical manifestations of this condition may include weakness in drinking, vomiting , attacks of fever , convulsions, reflex anomalies, shrill shrieking, apathy, muscular hypertonicity, cramps, opisthotonus, strabismus, nystagmus and apnea. The lethality rate is about 75%. Survival is accompanied by cerebral paresis, deafness and mental retardation Kuntz and Kuntz (2002) .


Resultados

HMOX1 promoter variants and CRC risk

HMOX1 L/M/S-allele carrier status was not found to be associated with CRC risk (Table 1) neither was the A(-413)T variation (Table 1). However, a diplotype analysis revealed that the A23/A30 diplotype (indicating A(-413)T and (GT)norte genetic variations (GT)23 belonging to the S allele class, while (GT)30 belonging to the M allele class) was associated with a substantially increased risk of CRC as it occurred only rarely in the control population. This association remained significant after adjustment for age and sex (OR 95%CI: 12.1 3.2–46.3, pag & lt 0,001). LD was strong for both analyzed promoter gene variants (D′ for A23 = −0.914, pag = 10 −20 and D′ for A30 = 0.923, pag = 10 −20 ).

UGT1A1 promoter variants and CRC risk

The UGT1A1*28 allele carrier status was associated with a 20% decrease in risk of CRC (Table 1). To determine if age influenced the results, both groups were stratified according to age into 10-year age groups. The CRC risk in these subgroups was estimated separately for men and women. A consistent protective effect of UGT1A1*28 allele was observed mainly in men, whereas in women, this effect was less pronounced. The overall results showed a substantial decrease in CRC risk in males (0.75 [0.58–0.96]), but only a nonsignificant decline in females (0.88 [0.66–1.18]). The logistic regression and the stratified analyses provided practically identical results. Therefore, the latter, more intuitive results are reported in our study.

Serum bilirubin levels in CRC patients and controls

CRC patients displayed significantly lower serum bilirubin levels, when compared to the controls (9.8 vs. 11.35 μmol/L, pag < 0.001 Fig. 1). This difference was more pronounced in males (10.08 vs. 12.8 μmol/L, pag < 0.001) than in females (9.17 vs. 10.22 μmol/L, pag = 0.023 (Fig. 1). As age and gender are potential confounders of the association between serum bilirubin levels and the CRC risk, we controlled for their effects by multiple binary logistic regression analysis. The results indicated that CRC risk was explained by serum bilirubin levels [OR (95% CI) = 0.93 (0.88–0.97)], age [OR (95% CI) = 1.08 (1.06–1.10)], but not gender [OR (95% CI) = 1.00 (0.65–1.55)]. Furthermore, the data also implied that each 1 μmol/L decrease in serum bilirubin was associated with a 7% increase in CRC risk (Table 2). When stratified according to gender, this association was again stronger in males than in females (Fig. 1). In accord with that the occurrence of unconjugated hyperbilirubinemia, similar to that found in individuals with Gilbert's syndrome (>17.1 μmol/L), was almost two times lower in CRC patients than in the control population [OR (95% CI) = 0.55 (0.31–0.98)]. In addition, a trend demonstrating possible association between low serum bilirubin and progressive cancer disease was observed (10.3 vs. 6.6 μmol/L, pag = 0.06 for patients with N1 compared to N3 disease 10.05 vs. 8.1 μmol/L, pag = 0.22, for patients with M0 vs. M1 disease), regardless of low statistical power.

Serum bilirubin levels in a subset of studied subjects. Data expressed as median and IQ range. Mann–Whitney Rank Sum test was used for comparison of analyzed variables.

Analysis of serum bilirubin levels in subjects clustered according to individual genotypes (Table 3) revealed that the presence of (TA)7 allele in the promoter of UGT1A1 is associated with increased serum bilirubin levels in both CRC patients and in control subjects (Table 3). The results also indicate that the number of GT repeats in the promoter region of HMOX1 did not affect serum bilirubin levels. However, the T(-413)T carriers had substantially lower serum bilirubin levels in both CRC and control groups (Table 3). Interestingly, a diplotype A23/A30 linked with an increased CRC risk was not associated with exceptionally low serum bilirubin levels, suggesting that these variants may modulate the CRC risk by some other mechanisms. The data consistently indicate that serum bilirubin levels were substantially lower in CRC patients within all studied genotype groups (Table 3).


Introducción

Vertebrates evolved with the UGT (UDP-gramolucuronosyltransferase) gene family, 1, 2 a set of endoplasmic reticulum-specific enzymes that catalyze the transfer of glucuronic acid from uridinediphospho-glucuronic acid to various lipophilic substrates. This reaction is crucial to the processing of bilirubin and endogenous hormones, the elimination of therapeutic drugs from the circulation, and the inactivation of environmental toxins. El humano UGT1A locus on chromosome 2q37 contains 13 promoters/first exons that encode nine proteins sharing a common C-terminus encoded by the 3′ exons 2–5. 3 The lead exon in any given transcript is predicted to be spliced to the four common exons to generate a functional enzyme. Each product is named for the UGT1A locus and an additional number representing the spliced first exon. For the enzyme product, this lead exon encodes the amino-terminal substrate specificity and the common exons encode the UDP-glucuronic acid-accepting domain. This multiple tandem exon structure is a shared feature of several important genes and may provide a common mechanism for directing cell- and tissue-specific gene expression. 4

Products of the UGT1A locus metabolize endogenous molecules such as thyroxine, estrone, and bilirubin. Of the nine UGT1A isoenzymes, UGT1A1 has the greatest bilirubin-conjugating activity, 1 required for elimination of bilirubin. Diminished production or activity of this enzyme leads to the hyperbilirubinemic syndromes described by Crigler–Najjar and Gilbert 5, 6, 7, 8 these syndromes have been associated with several common and rare variants of UGT1A1. 1, 8, 9, 10, 11 Genome-wide scanning of healthy human pedigrees has linked serum bilirubin levels most strongly to the chromosome 2q37 region containing UGT1A. 12 However, bilirubin levels also depend on the rate of production of bilirubin. Hence, the severity of inherited hemolytic syndromes such as glucose 6-phosphate dehydrogenase deficiency and sickle cell anemia may be exacerbated or mitigated by variants of UGT1A and these interactions may have affected the evolutionary history of this gene in different human populations. 13, 14, 15

While the primary selective pressure for UGT1A enzyme function may have been metabolism of endogenous molecules, UGT1A function is necessary for elimination of exogenous compounds such as the anti-cancer drug irinotecan. 16, 17, 18 The same common UGT1A1 variants associated with mild elevations of serum bilirubin are associated with diminished in vitro glucuronidation of the active irinotecan metabolite, SN-38, 19, 20, 21, 22 and prolonged exposure and increased toxicity in patients receiving this agent. 23, 24, 25 As shown by Sai et al., 25 re-sequencing of the UGT1A1 gene in 85 Japanese patients treated with irinotecan confirmed that the haplotypes containing lower expression variants were associated with both a low SN-38G/SN-38 AUC ratio and elevated pretreatment bilirubin concentration. Importantly, however, additional haplotypes appeared to have distinct modifying effects on the SN-38 AUC ratio and total bilirubin level phenotypes, suggesting that more complete genetic variation data for UGT1A may better predict bilirubin and irinotecan metabolism phenotypes. As common genetic variants of the UGT1A locus may better predict toxicity of irinotecan than conventionally used variables, 26 ongoing clinical trials have been designed to test the safety and efficacy of adjusting doses of irinotecan according to patients’ UGT1A genotipos.

For the anti-keloid/anti-allergy agent tranilast, hyperbilirubinemia is a common toxicity. 27 A staged, genome-wide analysis has associated three single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the UGT1A locus with this toxicity. 28 Although it is reasonable to assume that the association between hyperbilirubinemia and these pharmacologic agents is based on genetic variation at UGT1A1, for other metabolic/toxicologic phenotypes of UGT1A, the overlapping tissue distributions and substrate affinities of enzymes encoded by this locus may complicate interpretation of single genotype or single exon–haplotype association studies. As suggested by the results of Sai et al., 25 detailed knowledge of the interindividual genetic variability across this region, especially if focused on the segments most likely to affect expression and activity of these enzymes, could yield a better understanding of the pathopharmacology of new drugs.

The analysis of patterns of human variation is an important prerequisite for designing association studies aimed at assessing the role of genetic variation in drug response phenotypes. Re-sequencing approaches to the study of human variation may provide information to clarify the relative roles of common and rare variants on gene regulation and function. Para UGT1A, a re-sequencing approach is complicated by the size of the region, spanning approximately 200 kb. Many previous studies of the breadth of human diversity of pharmacologically relevant genes have focused on exon re-sequencing and in vitro assays of protein function. 29, 30 Such studies are likely to identify many functional variants, but may miss functional non-coding sequence variants, 31 as have already proved important for UGT1A1. 8, 11, 32 To focus on the regions of the entire UGT1A locus most likely to affect clinical phenotypes, we identified 29 kb of non-coding sequence highly conserved between humans and four mammalian species and re-sequenced these regions as well as over 8 kb of exon sequence in 72 individuals from three ethnic populations.

Typically, genotype/phenotype association studies of UGT1A have been performed on populations derived predominantly from a single population (e.g. Japanese, European, European-American), but the variants selected for genotyping are often based on allele frequency data generated from a population of greater ethnic diversity than the test group. To provide information useful to the interpretation of published studies and the design of future studies we present (1) a comparative genomics analysis aimed at identifying evolutionary conserved regions most likely to affect UGT1A function, (2) the relationship between the degree of sequence conservation across species and the proportion of polymorphic variants at conserved coding and non-coding sites, (3) the frequency distribution of coding variants as a function of the probability of an effect on enzyme function, and (4) differences in allele frequency and linkage disequilibrium (LD) of newly and previously identified variants in European-Americans, Asians, and African-Americans.


Resumen

Clinical studies show that individuals with elevated bilirubin concentrations, in the absence of liver pathology, are at reduced risk of CKD, CVD, and related mortality. Mildly elevated bilirubin concentrations are consistently associated with reduced vascular resistance (10, 52), improved eGFR (25, 145), renal tubular function, and slowing of the progression of kidney damage (1), in the absence of comorbidities including liver dysfunction and bacterial infection (42, 133, 167). Multiple mechanisms likely explain the protective effect of bilirubin (Fig. 3), including antioxidant and anti-inflammatory effects, suggesting that it could represent a biomarker and potential therapeutic target to reduce CKD/CVD risk (19). Indeed, recent studies have identified numerous molecules that either induce HO activity or partially inhibit UGT1A1, which could be used therapeutically to induce the protective effects of bilirubin in individuals at increased risk of CVD/CKD (81, 105, 184, 199).


Ver el vídeo: GPT GOT - AST ALT significado, análisis clínicos explicados (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Dorn

    ¡Muchas gracias! Todavía hay una razón para divertirme... Con su permiso, lo tomo.

  2. Fauzil

    ¿Pero otra variante es?

  3. Tojalkree

    ¡Aquí hay un volante!

  4. Chalmers

    Disculpe, he eliminado esta frase



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