Información

Tinción de anticuerpos

Tinción de anticuerpos



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Estoy teñiendo secciones de tejido y cometí un error, se suponía que tenía que mezclar 3 anticuerpos primarios pero teñí solo con uno de ellos. Después de 1 hora de incubación lavé 10 minutos con PBS y luego hice otra hora de incubación con los 2 anticuerpos que olvidé agregar antes. ¿Eso puede afectar mi tinción? Me temo que quería probar una dilución diferente del primer anticuerpo que agregué solo, y luego agregué otra hora de incubación con 2 anticuerpos más.


¿Es esto un ELISA? En ese caso, le sugiero que vuelva a realizar este experimento porque ahora está incubando durante una hora más. El tiempo de incubación se establece en un rango fijo porque aumentarlo también puede aumentar el ruido de fondo de su ensayo.

Tiempos de incubación: la sensibilidad puede aumentar con un tiempo de incubación más prolongado a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que la parte superior de la curva puede aplanarse y quedar inutilizable, lo que limita el rango del ensayo. Además, el fondo puede aumentar

Recursos: https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf


Generalmente, para la tinción IHC / ICC por separado con los anticuerpos no es un problema. La tinción con pasos de anticuerpos primarios separados a menudo se realiza cuando los anticuerpos son de especies incompatibles y, por lo tanto, pueden reaccionar de forma cruzada entre sí dando una tinción no específica.

Sin embargo, el lavado de 10 minutos y la incubación de 1 hora con los otros anticuerpos pueden eliminar parte del primer anticuerpo, dejándolo con una señal más débil de lo esperado. Esto puede afectar el aspecto "brillante" de la mancha después del paso del anticuerpo secundario.


Examine la tabla a continuación para conocer las posibles causas de la ausencia de manchas y cómo solucionarlo o prevenirlo por completo.

Posibles Causas

Soluciones

El anticuerpo primario y el anticuerpo secundario no son compatibles

  • Asegúrese de utilizar un anticuerpo secundario que se generó contra la especie de anticuerpo primario.
  • Asegúrese de que los isotipos del primario y el secundario sean compatibles.
  • Agregue una mayor concentración de anticuerpo primario
  • Incube la muestra durante más tiempo con el anticuerpo (por ejemplo, durante la noche) a 4 ° C.
  • Consulte la hoja de datos del anticuerpo para ver si el anticuerpo ha sido validado en el tipo de IHC que está utilizando (p. Ej., Fijación con formalina / PFA, congelado fresco, etc.).
  • Pruebe el anticuerpo en un western blot nativo (no desnaturalizado) para asegurarse de que no esté dañado.
  • Consulte las instrucciones de almacenamiento de sus productos en la hoja de datos.
  • Evite la congelación / descongelación excesiva.
  • Ejecute un control positivo.
  • Ejecute un control positivo.
  • Consulte la literatura científica para ver si se esperan proteínas en el tipo de tejido.
  • Utilice la amplificación de la señal para maximizar la señal, por ejemplo, un anticuerpo secundario conjugado con biotina.
  • Mantenga siempre los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos en la oscuridad. La exposición a demasiada luz puede provocar fotoblanqueo.
  • Desparafinar las secciones por más tiempo y usar xileno nuevo.
  • Utilice diferentes métodos de recuperación de antígenos para desenmascarar el epítopo (por ejemplo, calor mediado con tampón de pH 6 o pH 9, enzimático, etc.).
  • Arregle secciones por menos tiempo.
  • Agregue un agente permeabilizante fuerte como Triton X al tampón de bloqueo y al tampón de dilución de anticuerpos. Consulte nuestro protocolo sobre técnicas de permeabilización.
  • Utilice un detergente menos estricto (por ejemplo, Tween 20 en lugar de Triton X). O simplemente elimine el agente permeabilizante de sus tampones. Consulte nuestro protocolo sobre técnicas de permeabilización.
  • Agregue azida al 0.01% al tampón de almacenamiento de anticuerpos.
  • Utilice tampón estéril nuevo (por ejemplo, nuestro PBS estéril).

El panel marcador de orgánulos

En colaboración con el proyecto Human Protein Atlas, hemos desarrollado una colección de marcadores de referencia dirigidos a diferentes ubicaciones subcelulares dentro de la célula. El enfoque desde el principio fue seleccionar objetivos y desarrollar anticuerpos para que fueran marcadores ideales para diferentes orgánulos.

El panel incluyó marcadores para 15 ubicaciones subcelulares diferentes, compuestas por 27 anticuerpos. Múltiples anticuerpos dirigidos al mismo orgánulo con diferentes isotipos o epítopos le permite elegir el anticuerpo que mejor se adapta a su experimento y facilita la multiplexación.

Explore los marcadores de orgánulos

El panel completo Organelle Marker se presenta en nuestro catálogo de productos. Elija entre varios anticuerpos diferentes para cada orgánulo.


Tinción de anticuerpos de embriones de Parhyale hawaiensis

La gran diversidad de los planes corporales de los artrópodos, junto con nuestra comprensión detallada del desarrollo de la mosca de la fruta, convierte a los artrópodos en un taxón principal para examinar la diversificación evolutiva de los patrones de desarrollo y, por lo tanto, la diversidad de la vida existente. Los crustáceos, en particular, muestran una notable variedad de morfologías y constituyen un grupo exógeno útil para los insectos. El crustáceo anfípodo Parhyale hawaiensis se está estableciendo como un organismo modelo para los estudios de desarrollo dentro de los artrópodos. Este protocolo proporciona un protocolo simplificado para la tinción de anticuerpos de embriones de P. hawaiensis. El método también funciona bien para otros artrópodos y filos. Los embriones fijados se rehidratan, se lavan, se bloquean con suero de cabra normal y se incuban durante la noche con el anticuerpo primario. Luego, los embriones se lavan e incuban con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa que se une al anticuerpo primario. Una reacción histoquímica posterior produce una mancha negra en aquellas células donde se han localizado los anticuerpos.


Resultados

Diseño de un Pipeline Integrado para la Adquisición y Análisis de Grandes Experimentos de Monitoreo Inmunológico

La realización de un experimento de monitorización inmunitaria a gran escala durante un largo período de tiempo utilizando citometría de masas plantea varios desafíos. Uno, es imperativo monitorear el desempeño del instrumento y evaluar la calidad de los datos de la muestra para identificar fluctuaciones transitorias en el desempeño del instrumento que resultan en características tales como tinción disminuida para uno o más marcadores, mayor cantidad de residuos o doblete de lo habitual. Dos, los efectos de lote debido a variaciones experimentales o de instrumentos pueden ser una preocupación significativa. Si bien los investigadores siempre deben ser conscientes de cómo las fuentes técnicas pueden provocar variaciones, esto es especialmente pertinente cuando los datos se recopilan y adquieren durante semanas o meses. Por lo tanto, el diseño del experimento debe incluir mecanismos que detecten ambos tipos de fallas y alerten al investigador de manera adecuada. Finalmente, el papel de los operadores humanos debe minimizarse para reducir la variabilidad introducida por humanos. La toma de decisiones debe seguir un protocolo claro o confiar en métodos computacionales.

El conjunto de datos de expresión de anticuerpos descritos en este estudio integra múltiples técnicas para maximizar la reproducibilidad experimental y técnica y agilizar la adquisición y el análisis de datos (Figura 1). Las muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de tres donantes sanos (Figura 1A) se tiñeron con un panel de anticuerpos de 21 marcadores compuesto por marcadores para identificar de forma inequívoca todos los principales compartimentos inmunitarios: células B, células mieloides, células NK y células T. junto con una mayor granularidad para los subconjuntos dentro de estos compartimentos (como los monocitos CD16 & # x0002B / & # x02013 o las células B vírgenes frente a las de transición). Este panel de anticuerpos del núcleo se liofilizó como un cóctel único y se usó el mismo lote a lo largo de la adquisición de la muestra para minimizar la variabilidad experimental debido a la variabilidad del reactivo o al pipeteo. El panel solo utiliza un subconjunto de los canales disponibles en la citometría de masas, lo que permite a los investigadores incorporar 10 & # x0201315 marcadores adicionales para abordar preguntas específicas del experimento.

Después de la tinción del panel de anticuerpos del núcleo inicial, las muestras se dividieron en dos grupos para evaluar el impacto de la fijación en cada uno de los epítopos de anticuerpos evaluados posteriormente en esta pantalla. Este diseño también tipifica un diseño experimental común en el que un tratamiento (fijación) se compara con un control (muestras frescas). Las seis combinaciones paciente x tratamiento se codificaron con códigos de barras y se agruparon utilizando una estrategia de códigos de barras sin doblete compatible con células vivas que aprovechaba los anticuerpos CD45 conjugados con 4 isótopos distintos. Este enfoque de código de barras agiliza el procesamiento de muestras y minimiza la variabilidad potencial debido a la adquisición de diferentes pacientes o tratamientos en diferentes momentos. Los isótopos utilizados para los códigos de barras se eligieron específicamente para garantizar que el derrame potencial debido a las impurezas isotópicas o la formación de óxido de estos canales de códigos de barras no influiría en ninguno de los otros canales de anticuerpos que se miden en este experimento. A continuación, las muestras se distribuyeron uniformemente en cada uno de los 372 pocillos de un kit LEGENDScreen, cada uno de los cuales incluye un anticuerpo conjugado con PE contra un epítopo distinto. A continuación, con un anticuerpo anti-PE conjugado con metal permitió la medición de un conjunto completo de marcadores de superficie en todos los subconjuntos de células identificados por el amplio panel liofilizado. Finalmente, para agilizar la adquisición de datos, los conjuntos de 10 pozos se codificaron con barras y se combinaron utilizando una estrategia combinatoria que aprovechó cinco canales de paladio.

Las 38 muestras por lotes resultantes se adquirieron luego usando un citómetro de masas Helios (Figura 1B). La adquisición requirió alrededor de 400 h de tiempo del instrumento durante 5 semanas de operación y resultó en un total de 63 millones de eventos. El análisis manual de una cantidad tan grande de datos habría llevado mucho tiempo y habría puesto en riesgo la variabilidad introducida por el operador. Para evitar estos dos problemas, empleamos la plataforma de citometría de astrolabios estandarizada para excluir y limpiar los datos, etiquetar subconjuntos de células y realizar agrupaciones sin supervisión (Figura 3C). El análisis de Astrolabio tomó 24 h, y la plataforma & # x00027s & # x0201CAnalysis & # x0201D export se utilizó en todos los análisis de seguimiento.

Los datos de muestra sin codificación de barras son sólidos y coherentes en todas las muestras de pantalla

El conjunto de datos de tinción de anticuerpos implica una gran cantidad de muestras, un diseño de experimento complejo, un período de adquisición prolongado y un análisis computacional avanzado, cualquiera de los cuales podría introducir variabilidad u otros artefactos. Varias pruebas inspeccionan las distintas etapas del experimento (Figura 2). En primer lugar, una descodificación precisa es fundamental para todos los análisis de seguimiento. Este paso es especialmente desafiante debido al esquema de código de barras de dos niveles empleado: código de barras basado en CD45 del paciente x tratamiento y código de barras basado en paladio de cada lote de 10 anticuerpos LEGENDScreen. Astrolabio identifica correctamente los 60 códigos y su perfil de canal es distinto y sigue el diseño esperado (Figura 2A). Para validar el enfoque de descodificación computacional, los resultados se compararon con datos descodificados manualmente para uno de los lotes. Los dos métodos mostraron una alta concordancia de acuerdo con cuatro métricas estadísticas diferentes (Figura 2B), lo que respalda el uso del enfoque computacional más eficiente para excluir las 2232 muestras.

Figura 2. La frecuencia del subconjunto y la intensidad del marcador son consistentes en toda la adquisición del experimento LEGENDScreen. (A) Descodificación del mapa de calor para un lote de los 38. Las filas son eventos descodificados, las columnas son canales de códigos de barras. La intensidad del mosaico es la mediana del canal en los eventos. Astrolabio descodificó correctamente todos los códigos de este lote. (B) Gráfico de barras que compara la descodificación de Astrolabio con la descodificación manual utilizando cuatro puntuaciones de precisión: precisión (0,996), recuperación (0,914), puntuación F1 (0,953) y coeficiente de correlación de Matthews (MCC, 0,943). (C) Gráfico de dispersión del análisis de componentes principales (PCA) sobre los vectores de frecuencia del subconjunto de celdas para todas las muestras. Los ejes son componentes primero y segundo, los puntos son muestras codificadas por colores por donante. Los tres donantes son distintos entre sí e internamente uniformes en toda la adquisición. (D) Para cada par, el gráfico superior es un gráfico de dispersión de la frecuencia del subconjunto de células en todas las muestras, ordenadas por lote. El gráfico inferior es un gráfico de caja de la intensidad del marcador canónico en todos los lotes. De arriba a abajo: intensidad de linfocitos T y CD3, intensidad de linfocitos B y CD19, intensidad de linfocitos NK y CD56, e intensidad de monocitos CD14 & # x0002B y CD14. En todos los casos, tanto las frecuencias como las intensidades son sólidas durante el período de adquisición.

El punto de partida para el conjunto de datos fue sangre de tres donantes sanos. Después del tratamiento fijo frente al tratamiento fresco y la introducción de los anticuerpos del kit & # x00027s, cada uno de estos individuos conduce a varios cientos de muestras diferentes. Sin embargo, se espera que el perfil inmunológico del donante individual en cada conjunto de muestras sea idéntico y, por lo tanto, los datos adquiridos deben ser altamente comparables. Esto se refleja en el mapa de análisis de componentes principales (PCA) sobre las frecuencias del subconjunto de celdas de muestra (Figura 2C). Las muestras se distribuyen en tres islas bien separadas. Cada isla corresponde a un individuo, lo que significa que el perfil inmunológico es constante durante la adquisición.

Además, aplicamos la frecuencia de superposición promedio (AOF) como una métrica para evaluar la calidad de la tinción de los marcadores individuales en todos los lotes de muestras (38). Este paso de control de calidad identificó problemas con la tinción de múltiples marcadores en tres de los lotes (Figura complementaria 1A). Una inspección más detallada de la puntuación destacó varios marcadores problemáticos (Figura complementaria 1B). La evaluación de los datos de una sola célula para uno de estos marcadores, CD27, reveló un aumento dependiente del tiempo en la tinción de fondo que resulta en una resolución reducida del marcador con el tiempo, que atribuimos a un mal funcionamiento del instrumento Helios durante la adquisición (Figura complementaria 1C). Sin embargo, restringir el análisis a solo los eventos en el primer trimestre de la ventana de adquisición para estos lotes dio como resultado valores de AOF dentro del rango de otros lotes, lo que permitió la recuperación de datos de detección de anticuerpos válidos a pesar de los problemas técnicos (Figura complementaria 1D). La rápida identificación, aislamiento y solución de estos artefactos técnicos fue facilitada por un enfoque de control de calidad estandarizado utilizando la métrica AOF bien definida.

Excepto por los efectos por lotes identificados por el AOF QC, el conjunto de datos fue consistente en todos los subconjuntos de células y las intensidades de los marcadores (Figura 2D). Para cuatro subconjuntos de células principales (de arriba a abajo: células T, células B, células NK y monocitos CD14 & # x0002B), examinamos la frecuencia en cada muestra (panel superior de cada uno, ordenado por lote). La frecuencia de los subconjuntos tiene una variación muy pequeña en todas las muestras de un donante determinado. Además, la distribución del marcador canónico de cada subconjunto (CD3, CD19, CD56 y CD14, respectivamente) también es consistente en las muestras (panel inferior de cada uno, un cuadro para cada lote).

La combinación de las medidas de control de calidad anteriores destaca la solidez general del conjunto de datos de tinción de anticuerpos. Los datos de tinción generales fueron coherentes para cada donante y para cada subconjunto de células entre los donantes, y los problemas de adquisición específicos se identificaron y abordaron utilizando métricas de control de calidad automatizadas.

La plataforma Astrolabe etiqueta correctamente los subconjuntos de celdas y proporciona un agrupamiento significativo sin supervisión

La plataforma Astrolabe etiquetó automáticamente subconjuntos de células inmunes canónicas (Figura 3). Al igual que con la descodificación, es imperativo verificar que los métodos automatizados de anotación de celda se correspondan con las definiciones históricas calculando la superposición con la activación manual. El coeficiente de correlación de Matthews (MCC) entre los dos métodos fue & # x0003E0.8 para casi todos los subconjuntos de celdas (Figura 3A). Los gráficos biaxiales de marcadores canónicos reforzaron aún más la superposición (Figuras complementarias 2A y # x02013C). Cuatro de los subconjuntos tenían una puntuación inferior a 0,8, lo que indicaba alguna discrepancia entre el etiquetado computacional y el control manual. En los cuatro casos, el desacuerdo se debió al umbral subjetivo de un marcador específico (Figura complementaria 2D): estos son casos en los que el umbral de intensidad del marcador exacto para un subconjunto dado es ambiguo, como dónde trazar la línea en CD24 para distinguir Naive y células B de transición. Es importante destacar que el enfoque automatizado permitió un umbral consistente en todas las muestras en estos casos ambiguos, evitando la subjetividad humana potencial y la variabilidad en la asignación de puertas entre las muestras.

figura 3. Subconjunto de células y subconjuntos de perfiles utilizando la plataforma Astrolabe. Las células se agruparon utilizando el algoritmo FlowSOM y se etiquetaron de acuerdo con la jerarquía de activación canónica. (A) Gráfico de barras que compara el etiquetado de Astrolabio con la puerta manual en todos los subconjuntos de celdas utilizando el coeficiente de correlación de Matthews (MCC). La línea Jade corresponde a MCC de 0.9, la línea gris a MCC de 0.8. Casi todos los subconjuntos de células tienen un MCC alto, lo que denota un acuerdo entre los métodos automático y manual. (B) Mapa de calor de subconjunto de celdas para una muestra de ejemplo. Las filas son subconjuntos de celdas, las columnas son canales. La intensidad del mosaico es la mediana del canal en un subconjunto. (C) Gráfico de barras de las frecuencias medias del subconjunto de células en cada donante. (D) Perfilar el mapa de calor del subconjunto para la misma muestra de ejemplo. (MI) Gráfico de barras de las frecuencias medias del subconjunto de perfiles en cada donante.

Los perfiles de intensidad del marcador para cada uno de los subconjuntos etiquetados por la plataforma siguen en gran medida las definiciones de consenso HIPC [Figura 3B, (30)]. Astrolabio identificó consistentemente 11 subconjuntos de células T (incluidas las células T CD4 & # x0002B y CD8 & # x0002B, y los subconjuntos Naive, EMRA, EM y CM dentro de cada uno), 6 subconjuntos de células B, varios subconjuntos mieloides, subconjuntos de células NK, granulocitos y células NKT . El examen de las frecuencias de subconjuntos de células en los tres donantes destacó una clara variabilidad en sus respectivos perfiles inmunes (Figura 3C), lo que refuerza aún más los resultados de PCA anteriores.

El descubrimiento de nuevos subconjuntos de células definidos por patrones de expresión de marcadores que antes no se apreciaban es una de las promesas más interesantes de la citometría de alta complejidad, como la citometría de masas. Si bien el etiquetado de subconjuntos de células sigue las tendencias establecidas, la agrupación no supervisada tiene el potencial de descubrir señales previamente desconocidas. Astrolabio incluye un paso de creación de perfiles, donde cada subconjunto de celdas definido se agrupa por separado (Figura 3D). El número de grupos se decide mediante una heurística que depende del número de células en cada subconjunto y de la heterogeneidad del marcador. En el conjunto de datos de tinción de anticuerpos, la plataforma devuelve 71 subconjuntos de perfiles, que luego se etiquetan de acuerdo con el marcador o marcadores que proporcionan la mayor separación entre ellos. En particular, varios subconjuntos de células T CD8 & # x0002B se desglosan en base a CD161, lo que sugiere células T similares a MAIT (39). Las células B ingenuas se diferencian según la IgD, mientras que las células NK se dividen según CD8. De manera similar a los subconjuntos de células canónicas, las frecuencias de los subconjuntos de perfiles varían entre los tres donantes (Figura 3E), lo que sugiere una heterogeneidad más amplia dentro de la población.

El conjunto de datos de tinción de anticuerpos define patrones de expresión de cientos de marcadores de superficie en 71 subconjuntos de células

Con 350 anticuerpos medidos en 71 subconjuntos de perfiles, el conjunto de datos de tinción de anticuerpos es una rica fuente de información sobre los patrones de expresión esperados en un sistema inmunológico sano. Con el fin de proporcionar una vista inicial del conjunto de datos de expresión completo, calculamos dos métricas para cada subconjunto de perfiles y combinación de anticuerpos (Figura 4A, Figura complementaria 3). La primera métrica es la mediana de la intensidad del marcador, que es más útil para definir la expresión de los marcadores que muestran una distribución unimodal dentro de un subconjunto determinado. Para reflejar mejor los patrones de expresión bimodal, o aquellos en los que solo un subconjunto de células son positivas para un marcador dado, usamos un pozo en blanco que carecía de cualquier anticuerpo primario de PE para establecer una línea de base para la segunda métrica, porcentaje de células positivas. Establecimos un límite arbitrario en el percentil 99 del pozo en blanco y definimos cualquier celda por encima de este valor como positiva para el marcador. El mapa de calor resultante proporciona dos estadísticas resumidas independientes de la expresión del marcador en todos los subconjuntos de creación de perfiles.

Figura 4. Resumen de las intensidades de anticuerpos LEGENDScreen en todos los subconjuntos de perfiles. (A) Mapa de calor de todos los anticuerpos en todos los subconjuntos de perfiles. Las filas son anticuerpos, las columnas son subconjuntos de perfiles. El tamaño del mosaico es un porcentaje positivo y la intensidad es la intensidad media. Las tres secciones resaltadas corresponden a (B & # x02013D). (B & # x02013D) Vista más grande de estas secciones del mapa de calor principal. Las secciones se eligieron para que se correspondan en términos generales con la parte superior, media e inferior del mapa de calor. (MI) Gráfico de dispersión que compara la intensidad media de anticuerpos entre el experimento LEGENDScreen y un experimento de validación independiente utilizando una cuarta muestra de donante que se procesó y adquirió por separado. El eje X es la intensidad media en la validación, el eje Y es la intensidad media en LEGENDScreen. Cada punto corresponde a un subconjunto de células y una combinación de anticuerpos (rho de Pearson & # x00027s es 0,78). (F) Gráfico de dispersión que compara el porcentaje positivo entre experimentos. Los porcentajes son la frecuencia de los marcadores en cada cuadrante (prueba Chi-cuadrado de McNemar & # x00027s pag-valor es inferior a 2,2 & # x0201316).

Centrarse en cualquier sección específica del mapa de calor revela una plétora de patrones relevantes. La parte superior del mapa está poblada con marcadores bien establecidos (Figura 4B), como CD7, que está presente en todos los perfiles de células T y células NK, y CD11b, que se expresa más en los monocitos. Esta sección también destaca una limitación del conjunto de datos con CD5: si bien esto generalmente se considera un marcador de células pan-T, la pantalla solo mostró expresión en células T Naive CD4 & # x0002B, y no en ninguna otra célula T CD4 & # x0002B. Este patrón de tinción idiosincrásico podría deberse a muchas razones potenciales, como las limitaciones del kit LEGENDScreen, el clon de anticuerpos utilizado o las características específicas del protocolo Helios que empleamos. Esto sirve como un recordatorio importante para los investigadores que buscan utilizar este recurso: al igual que con cualquier otro cribado biológico, las señales específicas deben validarse aún más antes de confiar en ellas.

Las secciones inferiores del mapa de calor permiten la investigación de muchos marcadores de superficie que aparecen con menos frecuencia en la literatura científica (Figura 4C). En particular, la pantalla reproduce la expresión de CD180 en células B (40) y la expresión de CD193 en basófilos (41), al tiempo que revela nuevos patrones potenciales como la expresión de CD181 por granulocitos y basófilos. Además, muchos marcadores son expresados ​​por subconjuntos de células mieloides hasta cierto punto. Queda por ver si esto es un artefacto de la técnica experimental empleada aquí, o si existe un alto grado de heterogeneidad de células mieloides que aún queda por definir. Esta tendencia continúa en todo el mapa de calor (Figura 4D), al igual que algunas señales más esquivas, como CD371, que tiene un patrón de expresión accidentado en subconjuntos de perfiles diversos y aparentemente no relacionados.

Con el fin de proporcionar alguna validación externa para el conjunto de datos, realizamos un segundo experimento LEGENDScreen independiente utilizando PBMC de un cuarto donante y comparamos las medianas de los marcadores (Figura 4E) y el porcentaje positivo (Figura 4F) entre los dos experimentos (Tabla complementaria 4). Las métricas están correlacionadas entre los experimentos (Pearson & # x00027s rho de 0,78 y 0,73, respectivamente). Para el porcentaje positivo, el 88,2% de los marcadores se encuentran en el cuadrante inferior izquierdo o superior derecho de la gráfica, lo que muestra una gran concordancia entre el experimento original y el experimento de validación (prueba Chi-cuadrado de McNemar & # x00027s pag-valor es inferior a 2,2 & # x0201316). Juntas, estas pruebas muestran que las tendencias observadas en este conjunto de datos son generalizables. Dicho esto, a diferencia del conjunto de datos principal, CD5 se expresa uniformemente en todos los subconjuntos de células T en los datos de validación (Figura complementaria 4), lo que refuerza aún más la importancia de la validación de las pantallas. El examen del conjunto de marcadores distantes de la diagonal no revela ninguna tendencia clara y es posible que sean el resultado de diferencias específicas de los donantes, variaciones técnicas entre los experimentos o ruido aleatorio.

Varios marcadores se expresan diferencialmente entre las células T CD161 & # x0002B y CD161- CD8 & # x0002B

Este recurso completo de anticuerpos ofrece oportunidades para identificar marcadores para interrogar o estratificar más subconjuntos de células inmunes específicos. Como prueba del principio de este enfoque, aprovechamos la inclusión de CD161 en el panel de tinción de anticuerpos del núcleo, un marcador que se expresa en gran medida en las células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) (42). Las células MAIT son un subconjunto de células T que muestran cualidades innatas (43), incluida una cadena TCR & # x003B1 invariante (44) y una capacidad inherente para responder a la infección (45). El perfil de Astrolabio identificó los subconjuntos CD161hi y CD161lo tanto para las células T CD8 & # x0002B de memoria central (CM) como para las células T CD8 & # x0002B de memoria efector (EM) (Figura 3D). Estos subconjuntos de perfiles se exploraron más a fondo en busca de tendencias de expresión de marcadores diferenciales (Figura 5). Al comparar la métrica de porcentaje positivo para cada anticuerpo y buscar un consenso entre los tres donantes, se identificaron seis marcadores expresados ​​diferencialmente en células CM (Figura 5A) y cuatro marcadores en células EM (Figura 5B).

Figura 5. Marcadores expresados ​​diferencialmente entre células T CD161 & # x0002B y CD161-CD8 & # x0002B. (A, B) Gráficos de dispersión que muestran el porcentaje positivo de cada marcador en diferentes tipos de células T CD8 y # x0002B. (A) corresponde a la Memoria Central (CM), (B) a Effector Memory (EM). Los ejes X e Y tienen un porcentaje positivo en las células CD161 y CD161 & # x0002B, respectivamente. Cada punto corresponde a un marcador en un paciente. La línea roja es regresión lineal. Los marcadores donde el residuo de regresión estandarizado absoluto es & # x0003E2 para los tres donantes están coloreados. (C) Gráficos biaxiales y gráficos de caja de la expresión de CD26 en células CM (izquierda) y EM (derecha). El eje X es CD161, el eje Y es CD26, cada punto es una celda. Las celdas y los cuadros están codificados por colores mediante CD161- (rojo) y CD161 & # x0002B (azul). (D) Lo mismo para la expresión de CD192. Los niveles de CD192 en monocitos (marrones) se proporcionan como referencia. (MI) Lo mismo ocurre con la expresión de CD183 en células CM. (F) Lo mismo ocurre con la expresión de CD57 en células EM. (GRAMO) Validación multiplexada de proteínas expresadas diferencialmente entre los subconjuntos CD161 & # x0002B y CD161- utilizando una muestra de PBMC independiente. Mapa de tSNE que destaca el fenotipo característico de alta dimensión del subconjunto de células CD161hi (azul). (H) Gráficos biaxiales que muestran la validación de la expresión de CD26, CD193, CD183 y CD57 en células T CD161- y CD161 & # x0002B CD8 & # x0002B.

Dos de estas tendencias se superponen entre los dos subconjuntos de células: un aumento de CD26 y una disminución de CD49d. CD26 se ha asociado previamente con células MAIT (46). Al examinar el anti-PE en el pocillo de CD26 LEGENDScreen (Figura 5C), hay un aumento de x4.5 veces en la intensidad en promedio entre las células CD161- y CD161 & # x0002B CM y un aumento de x7.2 veces en promedio entre CD161- y células EM CD161 & # x0002B. Para CD49d (Figura 5D), la disminución promedio en la intensidad es x1.2 y x1.5, respectivamente, lo que es de esperar dada la baja intensidad general para ese marcador.

CD192 (CCR2) se expresó diferencialmente entre las células CM CD161hi y CD161low, con un aumento medio de x3,6 veces en la intensidad en el subconjunto CD161hi (Figura 5E, izquierda). Solo se expresó diferencialmente para dos de los tres donantes en células EM (Figura 5E, derecha). CD192 participa en el reclutamiento de monocitos en sitios inflamatorios (47), una función que potencialmente podría ser compartida por las células MAIT. Cuando se examinan las intensidades de los marcadores a nivel de una sola célula, las células CD161hi están situadas entre las células CD161low y los monocitos y, por tanto, se clasificarían como CD192mid utilizando la nomenclatura de activación estándar. Además de estos marcadores que se regularon positivamente de forma selectiva en células CD161hi, la pantalla destacó la expresión reducida de CD183 en células CM CD161hi (Figura 5F) y CD57 en células EM CD161hi (Figura 5G).

Una de las limitaciones de este enfoque de cribado es que cada uno de los anticuerpos se perfila de forma independiente, lo que excluye los análisis de coexpresión de marcadores en el cribado. Para validar y explorar más a fondo los patrones de coexpresión de los marcadores identificados en la pantalla, teñimos de forma independiente una muestra de PBMC de un donante sano con un panel que incorpora varios de los marcadores expresados ​​diferencialmente identificados en la pantalla junto con Va7.2 TCR para identificar definitivamente MAIT celdas (Tabla complementaria 5). El análisis de tSNE en las células T CD8 controladas reveló que la población CD161hi tenía un fenotipo distinto en un espacio dimensional alto definido por la coexpresión de muchos de los marcadores identificados en la pantalla (Figura 5H y Figura 5 complementaria). Los patrones de expresión diferencial de CD26, CD192, CD183 y CD57 entre CD161hi y CD161low reflejaban en gran medida los que se ven en la pantalla inicial, validando independientemente estos resultados (Figura 5I).

La fijación de la muestra conduce tanto a la pérdida como a la ganancia en la intensidad de marcadores específicos

La fijación de formaldehído es un método útil para preservar las muestras de células, pero se ha asociado con cambios en los epítopos de la superficie celular y los perfiles de expresión de los marcadores [(34, 48), Figura complementaria 6]. Sin embargo, dada la prevalencia y la importancia de la fijación en los experimentos de citometría, existe una necesidad urgente de un estudio sistemático del efecto de la fijación sobre la intensidad del marcador para informar mejor la selección de marcadores y el diseño del panel en estudios que involucran muestras fijas.

El conjunto de datos de tinción de anticuerpos incluye dos condiciones para cada donante y muestras de anticuerpos: una teñida en fresco y teñida después de la fijación con formaldehído al 1,6%. Doscientos cincuenta y cinco de los marcadores LEGENDScreen tienen celdas cuya intensidad es mayor que el umbral en blanco. Para cada uno de estos marcadores, calculamos la relación entre la expresión mediana en cada una de las condiciones en todos los subconjuntos de células (Figura 6A). Establecimos arbitrariamente un umbral de cambio de 2 veces como indicativo de un cambio de intensidad significativo entre las condiciones. 173 (68%) de los marcadores estaban por debajo de ese umbral, lo que sugiere que no se ven afectados notablemente por la fijación.

Figura 6. Evaluación integral del efecto de la fijación sobre la intensidad del marcador. (A) Diagrama de caja que muestra la relación entre las intensidades medias en las muestras fija y fresca. El eje X es el anticuerpo, ordenado por la mediana de la proporción, el eje Y es el log10 de la proporción. Cada caja es un anticuerpo. La línea gris corresponde a intensidades medianas cero o iguales. (B) Mapa de calor de anticuerpos donde la señal se obtuvo de fresca a fija (log 10 de relación & # x0003E0.5). Las filas son anticuerpos, las columnas son subconjuntos de células. La intensidad del azulejo es el cambio de pliegue entre fijo y fresco. (C) Mapa de calor de anticuerpos donde la señal se perdió de fresca a fija (relación de log 10 inferior a & # x022120.5). La intensidad del azulejo es el cambio de pliegue entre fresco y fijo. (D) Distribuciones de intensidad para dos combinaciones (subconjunto de células, anticuerpo) donde la mediana era igual entre fresca (en rojo) y fija (en cian). El eje X es la intensidad del anticuerpo, el eje Y es la densidad. La línea discontinua es el cuantil 99 del blanco e indica el fondo. Los valores entre paréntesis son log10 (fijo / fresco) para este marcador en este subconjunto de celdas. (MI) Dos combinaciones (subconjunto de células, anticuerpo) en las que la mediana aumentó de forma fija (ganancia de señal). (F) Dos combinaciones (subconjunto celular, anticuerpo) donde la mediana disminuyó en fijo (pérdida de señal). (GRAMO) Izquierda, anticuerpo CD22 en basófilos, donde se perdió la señal. Derecha, anticuerpo CD22 en células B, donde la señal se mantuvo constante. El efecto de fijación difirió entre los subconjuntos. (H) Gráfico de dispersión que compara la proporción de fijo y fresco entre el experimento LEGENDScreen y un experimento de validación donde los anticuerpos indicados eran parte del panel de citometría de masas (no conjugado con anti-PE). El eje X es la proporción en la validación, el eje Y es la proporción en LEGENDScreen. Each dot is a (cell subset, antibody) combination. Color is antibody, shape is category (gain or loss).

Sixty-five of the markers have a 2-fold or more increase in fixed samples relative to fresh (Figure 6B). In other words, these markers gained additional signal when the sample was fixed. This increase in expression can either be an artifact of fixation or true expression of an antigen that was not detected in the corresponding fresh sample. While formaldehyde fixation may be expected to partially comprise the cell membrane, the samples in this screen were not explicitly treated with any permeabilizing agents, so we do not anticipate significant exposure of intracellular antigens. Furthermore, gains in expression were largely seen across most cell subsets, suggesting that in most cases these reflect non-specific staining artifacts following fixation. At the opposite end of the spectrum, 17 markers showed a 2-fold or more decrease from fresh to fixed and were thus classified as loss of signal (Figure 6C). Since only an existing signal can diminish, the lost pattern is specific to certain subsets.

Examining the ratio between the medians enables a broad survey of all antibodies over all subsets. However, it ignores the single-cell nature of the data. Closer examination of several marker intensity distributions reveals that when the ratio is around zero, the underlying distribution is usually maintained from fresh to fixed as well (Figure 6D). When marker intensity is gained, it typically only affects some of the cells within the subsets, while the low expression persists in others (Figure 6E). On the other hand, when signal is lost, it appears that fixation diminishes it completely (Figure 6F). These trends further reinforce the hypothesis that the signal gained by fixation is due to the protocol rather than the underlying biology. In almost all cases, changes in markers expression patterns showed similar trends across subsets expressing that marker. One notable expression was CD22, which was found to be expressed on both B cells and basophils in the fresh samples using the clone contained in the Legendscreen panel (S-HCL-1), consistent with previous descriptions of clone-specific CD22 expression on basophils (49, 50). However, fixation resulted in loss of expression specifically on basophils, but not on B cells (Figure 6G), reflecting differences in the fixation sensitivity of the CD22 conformational epitopes that are differentially expressed between B cells and basophils (51).

The LEGENDScreen kit includes antibodies conjugated to PE which are then measured by mass cytometry using an anti-PE secondary. It is possible that the effects of fixation observed here are not due to effects on the underlying antibody, but rather due to a more complex interaction that potentially includes the marker antibody, PE, and anti-PE. We therefore performed a validation experiment where seven of the gain or loss markers were incorporated into the mass cytometry panel (Figure 6H). For the three loss markers, the validation results confirm the effect we saw in the data set: the same subsets express these markers, and loss their signal after fixation. On the other hand, the results for the gain markers were mixed. While one of them (CXCR3) fully reproduced the screen results, the other two only lost their signal in some of the cell subsets.

Cytometry experiment design can be a daunting task due to the high number of variables that needs to be considered. There are many factors that could influence results in unknown ways, especially when employing a method such as fixation that has the potential to perturb the chemistry and kinetics underlying the assay. This antibody staining data set represents an accessible resource to identify and anticipate such potential effects.


Development of a Comprehensive Antibody Staining Database using a Standardized Analytics Pipeline

Large-scale immune monitoring experiments (such as clinical trials) are a promising direction for biomarker discovery and responder stratification in immunotherapy. Mass cytometry is one of the tools in the immune monitoring arsenal. We propose a standardized workflow for the acquisition and analysis of large-scale mass cytometry experiments. The workflow includes two-tiered barcoding, a broad lyophilized panel, and the incorporation of a fully automated, cloud-based analysis platform. We applied the workflow to a large antibody staining screen using the LEGENDScreen kit, resulting in single-cell data for 350 antibodies over 71 profiling subsets. The screen recapitulates many known trends in the immune system and reveals potential markers for delineating MAIT cells. Additionally, we examine the effect of fixation on staining intensity and identify several markers where fixation leads to either gain or loss of signal. The standardized workflow can be seamlessly integrated into existing trials. Finally, the antibody staining data set is available as an online resource for researchers who are designing mass cytometry experiments in suspension and tissue.


What We Offer:

The non-immunogenic character of HS makes this type of antibody difficult to raise, so the few hybridoma-derived mouse anti-HS antibodies such as JM403, 10E4 and 3G10 are valuable tools for HS research. Using any of our multiple HS antibodies that recognize subtle differences in HS patterning can be useful in applications such as flow cytometry allowing multiple cell types to be directly compared.

Fig. Proteoglycan structure with GAG chains linking from a core protein

AMSBIO offers quality heparan sulfate antibodies from the important clones (JM403, 10E4 and 3G10), which are ideal to the binding of HS for HSPG research. AMSBIO also provides various anti-HS antibodies, recognizing distinct HS substructures and well characterized in previous studies.

How 10E4, JM403, 3G10 antibodies and heparinase III enzymes work together

Fig. 1. Reactivity of 10E4, b) Reactivity of 3G10, c) Sensitivity of 10E4 and 3G10 to HSase.

Clones 10E4 and JM403 recognize common epitopes on heparan sulfate (HS), which can be found on both basement membrane and cell-associated HS species. The 3G10 clone recognizes a neo-epitope exposed by digestion with heparinase III (HSase I) enzyme as seen in figure 3 (which destroys reactivity to 10E4 and JM-403) so that the 3G10 clone can be used as control to 10E4 or JM-403 (and vice versa).


Build effective multicolor panels

When the emission spectra of two fluorophores overlap, spill over of one fluorophore into the detection channel of the other might be observed (e.g. FITC and PE). This can make it difficult to identify discrete populations without the use of spill over correction by a technique called compensation. Where possible, the spill over can be minimized by selecting fluorophores that have little or no overlap, however this is not always possible when using several fluorophores. A spectrum viewer can assist in obtaining the best fit emission profiles. Using fluorophores with little or no overlap for cell subset markers (e.g. T cell subsets) and closely overlapping fluorophores for mutually exclusive markers (such as CD3 and CD19) can prevent reduced sensitivity due to fluorescence spread.


Ethics declarations

Ethics approval and consent to participate

Not applicable for this study.

Competing interests

MS, PS and BHL have filed a patent application based on this work (US provisional patent application 62/515-180). BZY is an employee at BioLegend Inc., which is the exclusive licensee of the New York Genome Center patent application related to this work. All other authors declare that they have no competing interests.

Publisher’s Note

Springer Nature permanece neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.