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PCR y PCR a gran escala

PCR y PCR a gran escala


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Realicé PCR con 50 μL, que mostró una banda clara en la electroforesis en gel. Luego realicé una PCR a gran escala con 3650 μL, que mostró una banda poco clara en la electroforesis en gel. ¿Cuál puede ser la razón de esto? ¿Podría ser una pérdida de plásmido a pesar de que hay una banda, solo una muy poco clara? Cabe mencionar que la PCR única se realizó en verano y la gran escala se realizó ahora.


Hice la gran escala en un tubo Falcon y luego moví la mezcla a tubos de PCR que contenían cada uno 50 μL, por lo que las condiciones de PCR deberían ser las mismas que las de la amplificación de PCR simple.

Si todas las concentraciones de reactivo y las condiciones de ciclo son las mismas, sospecho que no mezcló suficientemente su reacción de gran volumen antes de dispensarla en alícuotas de 50 μL.

Cabe mencionar que la PCR única se realizó en verano y la gran escala se realizó ahora.

Si estaba usando la misma polimerasa y cebadores para las reacciones de pequeño y gran volumen, ¿se almacenaron adecuadamente los materiales en el ínterin? Las ADN polimerasas recombinantes en tampones de glicerol tienen una vida útil de meses a años, según las especificaciones del proveedor y las condiciones de almacenamiento, aunque debe esperar una actividad disminuida después de varios meses.


Evaluación comparativa de un kit comercial y dos ensayos de PCR desarrollados en laboratorio para el diagnóstico molecular de la toxoplasmosis congénita

La toxoplasmosis es una infección mundial que puede causar una enfermedad grave y se considera un problema de salud grave en Francia. La detección del parásito por métodos moleculares es fundamental para el diagnóstico de la enfermedad. La extrema diversidad de métodos y prestaciones de los ensayos de PCR de Toxoplasma hace que el uso de kits de PCR comerciales sea una alternativa atractiva, ya que ofrecen una oportunidad para la estandarización. Comparamos el rendimiento de tres métodos moleculares para la detección de ADN de Toxoplasma gondii en líquido amniótico: un método comercial que usa PCR anidada y dos métodos desarrollados en laboratorio, uno que usa PCR convencional y el otro PCR en tiempo real. Esta evaluación se basó en un ensayo de dilución en serie de ADN de T. gondii, tres muestras de líquido amniótico enriquecidas con T. gondii en diferentes concentraciones y una cohorte clínica de 33 muestras de líquido amniótico. El ensayo de dilución en serie de ADN de T. gondii mostró una sensibilidad mucho menor para el kit comercial que para los métodos desarrollados en laboratorio. Además, de 12 casos comprobados de toxoplasmosis congénita, el 91,7% se detectó mediante los ensayos desarrollados en laboratorio, mientras que sólo el 50% se detectó mediante el kit comercial. La falta de sensibilidad del método, en parte debido a la presencia de inhibidores de la PCR, fue el principal inconveniente del método comercial. Este estudio enfatiza que los kits de diagnóstico de PCR comerciales no funcionan sistemáticamente mejor que los métodos desarrollados en laboratorio cuidadosamente optimizados. Existe la necesidad de una evaluación exhaustiva de dichos kits por parte de grupos competentes, así como de estándares de rendimiento con los que se puedan probar los kits comerciales para mejorar la confianza en aquellos seleccionados por los proveedores de atención médica.


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PCR Biosystems desarrolla y fabrica kits y reactivos de PCR para la investigación y el diagnóstico de biología molecular. Después de más de 20 años de experiencia en la industria, los cofundadores Mark Stevens y Alex Wilson lanzaron la empresa en 2012 con el objetivo de hacer las cosas de manera diferente. El enfoque ha sido la creación de reactivos de PCR de alto rendimiento que simplifican la investigación de los clientes y componentes de precisión para ayudar a los socios en el desarrollo de ensayos de diagnóstico.

Ahora, nueve años después, PCR Biosystems tiene una cartera de reactivos diseñados utilizando ensayos patentados y tecnología de pantalla inteligente, que cubre un amplio espectro de aplicaciones de PCR. Es importante destacar que PCR Biosystems también opera bajo un sistema de gestión de calidad certificado ISO 13485: 2016, lo que significa que los productos y procesos cumplen con los estándares internacionales para la fabricación de componentes de dispositivos médicos.

Durante la pandemia, la atención se centró en gran medida en la PCR. Cuéntenos sobre su nuevo producto qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect, cómo se produjo su lanzamiento y para qué se puede utilizar.

Alex: “QPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect se lanzó al principio de la pandemia, específicamente para respaldar las pruebas de alto rendimiento para el SARS-CoV-2 (el virus responsable de COVID-19). Este producto es un kit 4x RT-qPCR de alta concentración diseñado para la detección rápida y precisa de secuencias de ARN viral. Todo lo que se requiere es la adición de cebadores y sondas específicos, junto con el extracto de hisopo y el agua. Un beneficio clave para los usuarios es la capacidad de agregar más muestra a sus reacciones para aumentar la sensibilidad analítica, incluso cuando se trabaja con reacciones de pequeño volumen.

Al desarrollar qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect, nuestro objetivo es ofrecer a los investigadores y fabricantes de kits de diagnóstico flexibilidad en el desarrollo de sus ensayos y máxima confianza en la calidad y precisión de los resultados generados ".

¿De qué otra manera ha ayudado PCR Biosystems a apoyar la lucha contra COVID-19?

Alex: “Como se puede imaginar, la demanda de reactivos rápidos y fiables se disparó a medida que la gravedad de la crisis golpeó. Además de qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect, nuestra cartera prepandémica ya incluía una gama de productos que podrían usarse para las pruebas de COVID-19, e inmediatamente aumentamos la producción de estos reactivos críticos.

Para respaldar las pruebas a gran escala, presentamos tamaños de envases a granel de nuestros productos clave, lo que garantiza la consistencia, la conveniencia y el valor para las pruebas de alto rendimiento de muestras clínicas. Además, validamos nuestra gama qPCRBIO Probe 1-Step para la detección cualitativa del ácido nucleico del SARS-CoV-2 utilizando las secuencias de cebador-sonda recomendadas por Charité, Berlín y los CDC (genes RdRp, E y N). Apoyar a los clientes con experiencia técnica en el desarrollo y ampliación de ensayos ha sido otro enfoque clave para nuestro equipo durante el año pasado.

A mitad de la pandemia, comenzamos a suministrar nuestro inhibidor de ARNasa Riboshield & # x2122 a medida como un producto independiente. Este reactivo protege el ARN y puede estabilizar objetivos de ARN como el SARS-CoV-2 en muestras, lo que garantiza resultados de diagnóstico fiables.

Recientemente, lanzamos IsoFast & # x2122 Bst 1-Step Mix, que proporciona un método alternativo a la PCR para la amplificación y el análisis de ARN viral. A través de sus capacidades de desplazamiento de cadena de ácido nucleico, la polimerasa Bst elimina la necesidad del paso de desnaturalización a alta temperatura asociado con las enzimas Taq tradicionales. Esto permite obtener resultados más rápidos y facilita la detección de bajo costo en el campo sin equipo de termociclado especializado ”.

Si bien muchas cadenas de suministro se han interrumpido debido a la pandemia, ¿cómo ha continuado PCR Biosystems ampliando y optimizando las operaciones para garantizar un suministro continuo?

Alex: “Desde el estallido de la pandemia, nos hemos comprometido a garantizar que los investigadores y las organizaciones de todos los mercados puedan acceder a los productos y servicios de PCR que necesitan. Ser ágiles y rápidos en responder ha sido fundamental en nuestra capacidad para cumplir con todos los pedidos de reactivos recibidos durante este tiempo, algo de lo que estoy increíblemente orgulloso.

Gracias a nuestra planificación de contingencias, implementamos de inmediato el trabajo por turnos para la producción, el ensamblaje y el cumplimiento de pedidos y tuvimos tres equipos independientes trabajando los siete días de la semana, con dos equipos comerciales completamente capacitados en reserva para brindar soporte operativo.

Incrementamos enormemente la fabricación de reactivos RT-qPCR y dirigimos a nuestros clientes hacia formatos a granel, reconociendo la inminente escasez de material de plástico. Tener una excelente relación con los proveedores ha sido crucial, y la mejora no solo de nuestro negocio, sino también del de nuestros proveedores críticos, un paso esencial en este proceso.

Con nuestras instalaciones de fabricación ampliadas, grandes reservas de existencias, capacidad para una mayor ampliación y un gran aumento de nuestro equipo de expertos en PCR, hemos podido cumplir con nuestro compromiso de un suministro ininterrumpido de reactivos y estamos en una buena posición para abordar cualquier problema. aumento futuro de la demanda ".

¿Qué depara el futuro para PCR Biosystems?

Alex: “Somos ambiciosos con nuestros planes futuros: invirtiendo masivamente en nuestras actividades de investigación y desarrollo e impulsando una gran línea de desarrollo de productos. La visión a largo plazo, tanto para la pandemia actual como después, es facilitar el acceso a los reactivos de diagnóstico y moleculares que ofrecen estabilidad y confiabilidad, particularmente para aplicaciones en el punto de atención. Con este fin, en breve lanzaremos una gama de reactivos de PCR Lyo-Ready. Estos productos se pueden liofilizar, un proceso de secado hasta obtener una forma sólida, lo que facilita el envío y el almacenamiento, aumenta la vida útil del producto y permite una mayor flexibilidad en el volumen de la muestra.

También continuaremos expandiendo nuestras asociaciones de distribución y colaboraciones de diagnóstico a medida que avanzamos hasta 2021 y más allá. En la lucha por los reactivos de prueba COVID-19, sabemos que algunas regiones fueron menos capaces de obtener los materiales necesarios de sus proveedores. Nos hemos beneficiado enormemente de una red de distribuidores altamente experimentada que apoya a los clientes con sus necesidades de reactivos en 39 países. Nuestro compromiso de suministrar a los sistemas sanitarios globales los productos y la experiencia necesarios seguirá siendo fuerte en el futuro de PCR Biosystems ”.

Para obtener más información, comuníquese con la sede del Reino Unido al + 44 (0) 20 3930 8101, envíe un correo electrónico a [email protected] o visite www.pcrbio.com

Tenga en cuenta: este es un perfil comercial

© 2019. Esta obra está autorizada bajo una Licencia CC BY 4.0.


Experimentos basados ​​en investigaciones para la introducción a gran escala a la PCR y los digestiones de enzimas de restricción

Dirección para correspondencia a: Departamento de Química, Universidad Xavier de Louisiana, 1 Drexel. Dr, Nueva Orleans, LA 70125, EE. UU. Correo electrónico: [email protected] [email protected] Buscar más artículos de este autor

Departamento de Química, Universidad Xavier de Louisiana, 1 Drexel. Dr, Nueva Orleans, Luisiana, 70125

KEJ y TJW contribuyeron igualmente a este trabajo.

Dirección para correspondencia a: Departamento de Química, Universidad Xavier de Louisiana, 1 Drexel. Dr, Nueva Orleans, LA 70125, EE. UU. Correo electrónico: [email protected] [email protected] Buscar más artículos de este autor

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Abstracto

La reacción en cadena de la polimerasa y la digestión con endonucleasas de restricción son técnicas importantes que deben incluirse en todos los planes de estudio de los laboratorios de bioquímica y biología molecular. Estas técnicas se enseñan con frecuencia a un nivel avanzado, lo que requiere muchas horas de tiempo de estudiantes y profesores. Aquí presentamos dos experimentos basados ​​en la investigación que están diseñados para cursos de laboratorio introductorios y combinan ambas técnicas. En ambos enfoques, los estudiantes deben determinar la identidad de una secuencia de ADN desconocida, ya sea una secuencia de genes o una secuencia de cebador, basándose en una combinación de tamaño de producto de PCR y patrón de digestión de restricción. El diseño experimental es flexible y se puede adaptar en función del tiempo y los recursos disponibles para la preparación del instructor, y ambos enfoques pueden adaptarse a un gran número de estudiantes. Implementamos estos experimentos en nuestros cursos con un total combinado de 584 estudiantes y tenemos una tasa de éxito del 85%. En general, los estudiantes demostraron un aumento en su comprensión de los temas experimentales, capacidad para interpretar los datos resultantes y competencia en habilidades generales de laboratorio. © 2015 por la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, 43: 441–448, 2015.

Puede encontrar información adicional de apoyo en la versión en línea de este artículo.

Tenga en cuenta: El editor no es responsable del contenido o la funcionalidad de la información de apoyo proporcionada por los autores. Cualquier consulta (que no sea contenido faltante) debe dirigirse al autor correspondiente del artículo.


Validación de PCR en tiempo real a gran escala en medidas de expresión génica de dos microarrays comerciales de oligonucleótidos largos

Fondo: Los microarrays de ADN se están convirtiendo rápidamente en una herramienta fundamental en la investigación genómica y biomédica basada en descubrimientos. Sin embargo, la confiabilidad de los resultados de los microarrays está siendo cuestionada debido a la existencia de diferentes tecnologías y métodos no estándar de análisis e interpretación de datos. En ausencia de un "estándar de oro" / "método de referencia" para las medidas de expresión génica, los estudios que evalúan y comparan el rendimiento de varias plataformas de microarrays han arrojado a menudo conclusiones subjetivas y contradictorias. Para abordar este problema, hemos realizado un experimento de PCR en tiempo real basado en el ensayo de expresión génica TaqMan a gran escala y hemos utilizado este conjunto de datos como referencia para evaluar el rendimiento de dos plataformas de microarrays comerciales representativas.

Resultados: En este estudio, analizamos los perfiles de expresión génica de tres tejidos humanos: cerebro, pulmón, hígado y una muestra de referencia humana universal (UHR) utilizando dos plataformas comerciales representativas de microarrays de oligonucleótidos largos: (1) Microarrays Applied Biosystems Human Genome Survey (basados ​​en en detección de un solo color) (2) Microarrays de oligo de genoma humano completo de Agilent (basado en la detección de dos colores). Se seleccionaron 1375 genes representados por ambas plataformas de microarrays y que abarcan un amplio rango dinámico en los niveles de expresión génica, para la validación de PCR en tiempo real basada en el ensayo de expresión génica TaqMan. Para cada plataforma, se realizaron cuatro réplicas técnicas en las mismas muestras de ARN total de acuerdo con los protocolos estándar de cada fabricante. Para las matrices de Agilent, se realizó una hibridación comparativa mediante la incorporación de Cy5 para ARN de cerebro / pulmón / hígado y Cy3 para ARN de UHR (referencia común). Utilizando el conjunto de datos de PCR en tiempo real basado en el ensayo de expresión génica TaqMan como conjunto de referencia, se evaluó el rendimiento de las dos plataformas de microarrays centrándose en los siguientes criterios: (1) Sensibilidad y precisión en la detección de la expresión (2) Correlación del cambio de pliegues con datos de PCR en tiempo real en tejidos emparejados, así como en perfiles de expresión génica determinados en todos los tejidos (3) Sensibilidad y precisión en la detección de expresión diferencial.

Conclusión: Nuestro estudio proporciona uno de los conjuntos de datos de "referencia" más grandes de mediciones de expresión génica utilizando la tecnología de PCR en tiempo real basada en el ensayo de expresión génica TaqMan. Este conjunto de datos nos permitió utilizar una tecnología de expresión genética alternativa para evaluar el rendimiento de diferentes plataformas de microarrays. Concluimos que los microarrays son herramientas de descubrimiento invaluables con una confiabilidad aceptable para el cribado de expresión génica en todo el genoma, aunque sigue siendo aconsejable la validación de cambios putativos en la expresión génica. Nuestro estudio también caracteriza las limitaciones de los microarrays, la comprensión de estas limitaciones permitirá a los investigadores evaluar de manera más eficaz los resultados de los microarrays de una manera más cautelosa y apropiada.


Reactivos y enzimas de PCR

Conozca la historia de la PCR, las consideraciones de configuración, la importancia de la elección de la ADN polimerasa, los métodos y aplicaciones comunes y la resolución de problemas.


Expresiones de gratitud

Agradecemos a A. Boehm por brindar información y apoyo de laboratorio en Stanford R. Martone y L. Sassoubre por sus útiles conversaciones sobre el diseño experimental Ofelia C. Romero-Maraccini, M. Mattioli y D. Lee por el apoyo técnico O. Shelton, J. Samhouri , G. Williams, S. Hennessey, A. Stier, B. Feist y P. Levin por discusiones analíticas relacionadas y apoyo de campo R. Morris y V. Armbrust por información y apoyo de laboratorio en UW y el Centro Helen R. Whiteley en Friday Harbor Laboratories por apoyar el taller de redacción que hizo avanzar sustancialmente este producto. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación David y Lucile Packard.


¿Cómo asegura una polimerasa de alta fidelidad que se inserte la base correcta?

Las ADN polimerasas de alta fidelidad tienen varias salvaguardas para proteger contra cometer y propagar errores al copiar ADN. Tales enzimas tienen una preferencia de unión significativa por el nucleósido trifosfato correcto frente al incorrecto durante la polimerización. Si un nucleótido incorrecto se une al sitio activo de la polimerasa, la incorporación se ralentiza debido a la arquitectura subóptima del complejo del sitio activo. Este tiempo de retraso aumenta la oportunidad de que el nucleótido incorrecto se disocie antes de la progresión de la polimerasa, lo que permite que el proceso comience de nuevo, con un nucleósido trifosfato correcto (1,2). Si se inserta un nucleótido incorrecto, corregir las ADN polimerasas tiene una línea de defensa adicional (Figura 1). Se detecta la perturbación causada por las bases mal aparejadas, y la polimerasa mueve el extremo 3 & agudo de la cadena de ADN en crecimiento hacia un dominio de exonucleasa 3 & aguda & rarr5 & aguda de corrección de pruebas. Allí, el nucleótido incorrecto es eliminado por la actividad exonucleasa aguda 3 & rarr5 & aguda, después de lo cual la cadena se mueve de nuevo al dominio de la polimerasa, donde la polimerización puede continuar.


Referencias

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Comentarios:

  1. Kigataur

    Los accesorios salen, una especie

  2. Whitfield

    No ha entendido todo.

  3. Hawley

    Especialmente registrado en el foro para decirle mucho por su ayuda en este asunto, ¿cómo puedo agradecerle?

  4. Salah Al Din

    Creo que permitirás el error. Ingrese lo discutiremos. Escríbeme en PM, hablaremos.

  5. Tojabar

    es falsedad



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